Bakterien

Das ISME Journal (2023)Zitieren Sie diesen Artikel

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Ruhe ist eine Anpassung an das Leben in schwankenden Umgebungen. Es ermöglicht Menschen, bei ungünstigen Bedingungen in einen reversiblen Zustand reduzierter Stoffwechselaktivität zu gelangen. Die Ruhephase kann auch die Interaktion zwischen Arten beeinflussen, indem sie Organismen einen Zufluchtsort vor Fressfeinden und Parasiten bietet. Hier testen wir die Hypothese, dass die Ruhephase durch die Schaffung einer Samenbank geschützter Individuen die Muster und Prozesse der antagonistischen Koevolution verändern kann. Wir führten ein faktoriell konzipiertes Experiment durch, bei dem wir einen bakteriellen Wirt (Bacillus subtilis) und seinen Phagen (SPO1) in Gegenwart bzw. Abwesenheit einer Samenbank bestehend aus ruhenden Endosporen passagierten. Teilweise aufgrund der Unfähigkeit von Phagen, sich an Sporen zu binden, stabilisierten Samenbanken die Populationsdynamik und führten zu minimalen Wirtsdichten, die 30-fach höher waren als bei Bakterien, die nicht in der Lage waren, in den Ruhezustand zu gehen. Indem wir phagenempfindlichen Stämmen einen Zufluchtsort bieten, zeigen wir, dass Samenbanken eine phänotypische Vielfalt bewahren, die sonst der Selektion verloren ginge. Die Ruhe bewahrte auch die genetische Vielfalt. Nach der Charakterisierung der Allelvariation mittels gepoolter Populationssequenzierung stellten wir fest, dass Samenbanken doppelt so viele Wirtsgene mit Mutationen behielten, unabhängig davon, ob Phagen vorhanden waren oder nicht. Basierend auf Mutationsverläufen im Verlauf des Experiments zeigen wir, dass Samenbanken die Koevolution von Bakterien und Phagen dämpfen können. Ruhe schafft nicht nur Struktur und Gedächtnis, die Populationen vor Umweltschwankungen schützen, sondern verändert auch die Arteninteraktionen auf eine Weise, die sich auf die ökoevolutionäre Dynamik mikrobieller Gemeinschaften auswirken kann.

Koevolution entsteht durch wechselseitige evolutionäre Veränderungen zwischen zwei oder mehr Arten. Unter Mutualisten ist die Koevolution auch ein wichtiger Prozess für das Verständnis der Wirt-Parasit-Dynamik [1]. Antagonistische Interaktionen beinhalten beispielsweise tendenziell die Auswahl von Verteidigungsstrategien, seien es Verhaltensmerkmale oder morphologische Merkmale, die die negativen Auswirkungen eines Parasiten auf die Fitness des Wirts verringern [2,3,4]. Im Gegenzug entwickeln sich Parasiten häufig weiter, um die Investition eines Wirts in Verteidigungsstrategien zu überwinden [5, 6]. Diese zugrunde liegenden Mechanismen der Koevolution können zu ökoevolutionären Rückkopplungen führen, die Auswirkungen auf die Vielfalt und Dynamik gekoppelter Populationen haben [7,8,9,10]. Die Komplexität der Koevolution wird außerdem durch Demografie [11], Paarungssysteme [12], Ernährung [13], Produktivität [14], Ausbreitung [15] und andere Merkmale beeinflusst, die zur Fitness des Organismus beitragen [16].

Ein Merkmal, das die Koevolution beeinflussen kann, ist die Ruhephase. Wenn viele Organismen durch schwankende oder suboptimale Bedingungen herausgefordert werden, interpretieren sie Umweltsignale und gehen daraufhin in einen metabolisch inaktiven Zustand über. Organismen können sich auch in unvorhersehbar lauten Umgebungen absichern, indem sie stochastisch zwischen Stoffwechselzuständen wechseln [17, 18]. Bei beiden Strategien entsteht durch die Ruhephase ein Reservoir inaktiver Individuen, das als „Samenbank“ bezeichnet wird. Obwohl sie nicht zur Fortpflanzung fähig sind, erfreuen sich ruhende Individuen einer geringeren Sterblichkeitsrate. Infolgedessen beeinflussen Samenbanken die Entwicklung und Ökologie von Populationen. Beispielsweise wird die genetische Drift durch eine Samenbank verringert, da dadurch die effektive Populationsgröße erhöht wird [19,20,21]. Darüber hinaus behalten Samenbanken Individuen in einer Population, die andernfalls anfällig für die Entfernung durch natürliche Selektion wären [22, 23]. Insgesamt kann der von Samenbanken bereitgestellte genetische Speicher Abstammungslinien vor dem Aussterben schützen und zur Erhaltung der Vielfalt innerhalb einer Population beitragen [24].

Samenbanken verändern auch die Interaktionen zwischen Arten auf eine Weise, die sich auf die Koevolution auswirken kann. Es ist allgemein bekannt, dass die Ruhephase durch den Speichereffekt die Koexistenz konkurrierender Arten ermöglicht. Dieses Phänomen spiegelt die Fähigkeit von Arten wider, unter günstigen Bedingungen zu wachsen und gleichzeitig Verluste unter ungünstigen Bedingungen aufgrund langlebiger Lebensstadien zu minimieren (25, 26). In ähnlicher Weise verändern Samenbanken die Dynamik antagonistisch interagierender Arten. Einerseits kann die Ruhephase durch indirekte Vorteile für Raubtiere und Parasiten verstärkt werden. Beispielsweise kann die Bildung von Ruhestrukturen durch Zooplankton von Krustentieren (Daphnia pulex) die Überweidung mikrobieller Ressourcen begrenzen und die Amplitude der Räuber-Beute-Zyklen verringern [27]. Andererseits deuten Beobachtungen verschiedener Arten, von Bakterien bis hin zu Nagetieren, darauf hin, dass die Ruhephase der Beute einen Zufluchtsort vor Organismen bieten kann, die sie infizieren oder verzehren [28,29,30]. Dennoch scheinen einige Parasiten die Ruhephase des Wirts auf eine Weise übernommen zu haben, die ihr Überleben und ihre Übertragung erhöht [31,32,33]. Während diese Beobachtungen theoretische Arbeiten zur Untersuchung des Zusammenspiels zwischen Ruhephase und Koevolution der Wirt-Parasit-Dynamik inspiriert haben, fehlen empirische Tests [34, 35].

Seit Jahrzehnten werden Bakterien- und Phagengemeinschaften zum Testen der Koevolutionstheorie verwendet [36]. Mikrobenstämme können in kleinen Mengen über Hunderte bis Tausende von Generationen zusammengestellt, repliziert und vermehrt werden. Kurze Generationszeiten und große Populationsgrößen ermöglichen eine schnelle Entwicklung, die durch Längsschnittproben verfolgt werden kann [37]. In solchen Studien existieren Bakterien und Phagen häufig nebeneinander, was zum Teil auf die Dynamik des Wettrüstens und die von der negativen Frequenz abhängige Selektion zurückzuführen ist, was anhand von Infektionsnetzwerken und Genomsequenzierung nachgewiesen wurde [38,39,40]. Das wachsende Interesse an Virenabwehrstrategien bietet die Möglichkeit, neue Einblicke in die Koevolution von Bakterien und Phagen zu gewinnen [41]. Während viele Formen der Virusabwehr, wie Restriktionsmodifikation und CRISPR-Cas, innerhalb der Zelle stattfinden [42, 43], finden andere Formen der Resistenz auf der Oberfläche der Zelle statt. Im letzteren Fall werden Selektionsziele häufig mit dem ersten Schritt der Infektion in Verbindung gebracht, bei dem sich schwanzähnliche Strukturen eines Phagenpartikels an Pillen, Flagellen, Lipopolysaccharide oder andere Rezeptormoleküle anlagern, die sich auf der Außenmembran der Zelle befinden [38, 39, 44 ]. Letztendlich hängt die Koevolution von Bakterien und Phagen von den genetischen Loci, die ausgewählt werden, und den Fitnesskosten der entwickelten Stämme sowie von physischen oder physiologischen Refugien vor Phagen ab [45, 46, 47, 48].

Mikrobielle Systeme bieten auch eine Möglichkeit zu testen, wie die Ruhephase zur Koevolution beiträgt. Eine der am besten verstandenen Formen der Ruhephase ist die Endosporulation [49]. Wenn sie durch Ressourcenknappheit herausgefordert werden, durchlaufen Bakterien wie Bacillus und Clostridium einen komplexen Entwicklungsprozess, der eine aktiv wachsende vegetative Zelle in eine metabolisch inerte und langlebige ruhende Spore umwandelt [50, 51]. Die Wege, die die Endosporulation steuern, sind gut charakterisiert und für genetische Manipulationen zugänglich, die in experimentellen Evolutionsstudien genutzt werden können [52, 53]. Während die Endosporulation Toleranz gegenüber einem breiten Spektrum von Umweltstressoren verleiht, kann sie auch die Wechselwirkungen mit Phagen verändern [54]. Beispielsweise werden die für die Phagenanheftung benötigten Rezeptoren durch die sie umgebende Sporenhülle maskiert [55], was Bakterien resistent gegen Infektionen machen könnte. Dennoch könnten virale Parasiten diesen Abwehrmechanismus im Ruhezustand überwinden können. Jüngste Studien haben gezeigt, dass einige Phagen vom Wirt stammende Gene tragen, die die Endosporulation hemmen und so den potenziellen Zufluchtsort beseitigen können, der durch diese Art phänotypischer Plastizität entsteht [56, 57].

In dieser Studie führten wir Experimente mit einem sporenbildenden Bakterium (Bacillus subtilis) und seinem Phagen durch, um zu testen, wie die Ruhephase und die daraus resultierende Samenbank die ökoevolutionäre Dynamik eines sich gemeinsam entwickelnden Wirts und Parasiten beeinflussen. Nachdem wir eine Mutation in einem essentiellen Gen für die Sporulation entwickelt hatten, testeten wir, wie sich Samenbanken auf Infektionsraten, Populationsdynamik und Gemeinschaftsstabilität auswirken. Durch die Isolierung von Bakterien zu verschiedenen Zeitpunkten im Experiment konnten wir die Aufrechterhaltung phagenresistenter Phänotypen in der Wirtspopulation in Gegenwart und Abwesenheit einer Samenbank verfolgen. Mithilfe der gepoolten Populationssequenzierung haben wir auch Muster der molekularen Diversität und genetische Signaturen der Koevolution quantifiziert.

In unseren Experimenten verwendeten wir Bacillus subtilils 168 Δ6 (Tabelle S1) als bakteriellen Wirt. Bei diesem manipulierten Derivat des Modellstamms B. subtilis 168 wurden alle bekannten Prophagen aus seinem Genom entfernt und es ist in der Lage, Endosporen zu bilden [58]. Aus dem Δ6-Stamm haben wir einen nicht sporulierenden Wirt entwickelt, indem wir spoIIE gelöscht haben, ein Gen, das für die Endosporenbildung spezifisch und essentiell ist (siehe Ergänzungstext). Wir haben bestätigt, dass die spoIIE-Deletion weder die Fitness beeinträchtigt noch die Phageninfektion verändert hat (siehe Ergänzungstext). Wir kultivierten die sporenbildenden (Δ6) und nicht sporenbildenden (Δ6 ΔspoIIE) Bakterien in LB-Medium mit niedrigem Salzgehalt (5 g/l NaCl) oder Difco-Sporulationsmedium (DSM [59]). Die Medien wurden mit Chloramphenicol (5 µg/ml), gegen das die gentechnisch veränderten Bacillus resistent sind, Agar (15 g/L) zum Ausplattieren und CaCl2 (10 mM in LB und 1 mM in DSM) ergänzt, um die Phagenadsorption zu erleichtern. Als Parasit verwendeten wir in unseren Experimenten den Phagen SPO1 (Tabelle S1). Dieser virulente Phage gehört zur Familie der Herelleviridae [60], einer Gruppe von Viren mit Vertretern, die B. subtilis und andere Bacillota infizieren können [61]. SPO1 hat ein dsDNA-Genom (132 kb) und eine Myovirus-ähnliche Morphologie, einschließlich eines langen kontraktilen Schwanzes und eines ikosaedrischen Kopfes [62]. Um SPO1 zu verstärken, sammelten wir Lysate von Platteninfektionen, nachdem wir Petrischalen mit Puffer pH 7,5 (10 mM Tris, 10 mM MgSO4, 4 g/L NaCl, 1 mM CaCl2) geflutet hatten. Anschließend haben wir den phagenhaltigen Puffer durch Zentrifugation (7200 × g, 10 min) und Filtration (0,2 μm) von den Bakterien befreit.

Um die Bindung an Wirte zu charakterisieren, führten wir Adsorptionstests durch, bei denen wir den Prozentsatz der Phagenpartikel quantifizierten, die sich im Laufe der Zeit an Sporen und vegetative Zellen anhefteten [63]. Wir haben Sporen, die in einer Übernachtkultur in DSM produziert wurden, durch Lysozymbehandlung (50 µg/ml, 1 Stunde, 37 °C), gefolgt von SDS-Behandlung (0,05 %) und drei Wäschen in H2O gereinigt. Um eine Keimung zu verhindern, haben wir gereinigte Sporen in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (pH 7,5) resuspendiert, da keine für die Keimung erforderlichen Ressourcen vorhanden waren. Vegetative Zellen wurden aus einer Übernachtkultur in LB-Medium geerntet, gewaschen und in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (pH 7,5) resuspendiert. Um einen Adsorptionstest zu starten, haben wir vor der Probenahme 107-108 vegetative Zellen oder gereinigte Sporen mit ~104 Phagen (Infektionsmultiplizität = 10-3-10-4) in einem Schüttelinkubator für 5 Minuten bei 37 °C gemischt. Wir haben die Proben (0,2 µm) sofort gefiltert, um Zellen und adsorbierte Phagen zu entfernen, bevor wir den Titer nicht absorbierter Phagen mittels Plaque-Assays gemessen haben. Dies beinhaltete eine Doppelschichtausplattierung mit 0,3 % Agar-Overlays [64]. Wir haben den anfänglichen Phagentiter gemessen, indem wir einen Kontrollkolben ohne Zellen aufgestellt haben. Aus der Phagenhäufigkeit berechneten wir den Prozentsatz der Adsorption und testeten mithilfe eines einseitigen t-Tests, ob diese Werte größer als Null waren.

Wir führten ein faktoriell konzipiertes 2 × 2-Experiment durch, bei dem wir Bakterien und Phagen in Gegenwart oder Abwesenheit einer Samenbank seriell passagierten (Abb. 1). Für jede Versuchseinheit inokulierten wir 10 ml DSM mit 100 μl einer Übernachtkultur von B. subtilis, die mit einer einzelnen Kolonie von Δ6 (+ Samenbankbehandlung) oder nicht sporenbildendem Δ6 ΔspoIIE (- Samenbankbehandlung) begonnen wurde ). Die Hälfte der Versuchseinheiten (n = 3 für jede Samenbankbehandlung) wurde zufällig einer nicht infizierten Kontrollgruppe (-Phagen) zugeordnet, während die anderen 106 Plaque-bildende Einheiten (PFU) aus einem isogenen Lysat von SPO1 erhielten, um eine Multiplizität von zu erreichen Infektion von 0,0002 (+ Phagen). Sobald die Behandlungen festgelegt waren, hielten wir alle Populationen (n = 12) in 10 ml DSM in 50 ml Erlenmeyerkolben in einem Schüttelinkubator (200 U/min) bei 37 °C.

Bei der + Samenbankbehandlung verwendeten wir einen Stamm von Bacillus subtilis, der in der Lage war, Endosporen zu bilden, nachdem die Ressourcen durch Wachstum erschöpft waren (schwarze Pfeile). Darüber hinaus haben wir eine externe Samenbank (blau dargestellt) eingerichtet, um die Verweilzeit der Endosporen zu verlängern. Der erste Schritt dieses Prozesses umfasste die Reinigung von Endosporen durch Wärmebehandlung (Flamme = 80 °C, 20 Min.), wodurch Phagen und vegetative Zellen aus einer Probe entfernt wurden, die aus der in einem Kolben enthaltenen Fokuspopulation entnommen wurde. Dann vermischten wir diese Endosporen mit Endosporen, die aus früheren Transfers erhalten und auf die gleiche Weise erhalten wurden. Diese Sporenmischung (d. h. externe Samenbank) und eine unbehandelte Probe aus einer Fokuspopulation wurden zum Beimpfen von frischem Medium und zur Etablierung des nächsten Transfers verwendet. Bei der Behandlung mit der Samenbank wurden serielle Übertragungen (schwarze Pfeile) mit einem mutierten Stamm von B. subtilis durchgeführt, der nach Erschöpfung der Ressourcen aufgrund einer manipulierten Mutation in einem Gen, das für die Sporulation essentiell ist, nicht in der Lage war, Endosporen in reichhaltigem Medium zu produzieren ( spoIIE). Nachdem wir die Samenbank mit einem ersten seriellen Transfer (t-1) eingerichtet hatten, begannen wir das Experiment bei t0, indem wir die Hälfte der Populationen mit dem Phagen SPO1 infizierten. Der Einfachheit halber werden nicht infizierte Kontrollen nicht angezeigt. Weitere Einzelheiten finden Sie unter Methoden.

Wenn Δ6 in DSM gezüchtet wird, erschöpft es schnell die Ressourcen, was die Sporulation fördert. Beispielsweise machten Endosporen nach 48-stündiger Inkubation 65 ± 7 % (Mittelwert ± Standardabweichung, n = 3) der Population aus. Beim Transfer in frisches Medium keimten diese Sporen jedoch mit einer Rate von 50 % h-1 (Abb. S1), was das Potenzial hat, die Ansammlung ruhender Individuen aus früheren Transfers zu begrenzen, wenn Populationen seriell übertragen werden. Deshalb haben wir eine altersstrukturierte externe Samenbank erstellt, die es uns ermöglichte, alte und neue Endosporen ohne Keimverlust zu mischen (Abb. 1). Endosporen aus der externen Samenbank konnten dann wieder zur Fokuspopulation hinzugefügt werden, sodass die Verweilzeit der Endosporen in unserem Experiment verlängert wurde (siehe Ergänzungstext). Zu Beginn haben wir Zellen geerntet und zweimal mit gleichen Volumina phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH = 7,4) in einer Zentrifuge (8000 × g, 5 Min.) gewaschen, um restliches Medium zu entfernen, das die Sporenkeimung auslösen könnte. Um Endosporen zu isolieren, haben wir die Proben anschließend wärmebehandelt, um Phagen und vegetative Zellen abzutöten (80 °C, 20 Minuten). Bei jedem Transfer wurden dann isolierte Endosporen zur Samenbank hinzugefügt, indem sie mit den Samenbank-Endosporen des vorherigen Transfers in einem Volumenverhältnis von 4:1 (neu:alt) gemischt wurden. Zuletzt haben wir bei der nächsten seriellen Übertragung eine Probe dieser neu gemischten Samenbank wieder zur Fokuspopulation hinzugefügt (Abb. 1).

Um die Populationsdynamik zu verfolgen, haben wir Bakterien und Phagen im Laufe der Zeit seriell passagiert. Bei jedem Transfer haben wir 1 % der Population (100 μl) in frisches Medium in einem neuen Erlenmeyerkolben aliquotiert (Abb. 1). Für Populationen, die der Samenbankbehandlung + zugeordnet wurden, übertrugen wir 50 μl einer unbehandelten Populationsprobe und 50 μl der Samenbank zur Kontrolle der Gesamtinokulumgröße. Wir transferierten jede Population 28 Tage lang jeden zweiten Tag, also insgesamt 14 Transfers, was etwa 90 Wirtsgenerationen entsprach. Wir haben jede Versuchseinheit täglich beprobt, um die Populationsgröße zu quantifizieren (siehe unten). Bei jedem Transfer (48 Stunden) konservierten wir Proben der Wirts- und Phagenpopulationen zur Beurteilung der phänotypischen und molekularen Entwicklung (siehe unten). Bakterien wurden durch Zugabe von Glycerin (15 % Volumen pro Volumen) zu einer Populationsprobe vor der Lagerung bei –80 °C konserviert. Zur Konservierung bakterieller Endosporen haben wir externe Samenbanken bei 4 °C gelagert. Zur Konservierung von Phagenlysaten wurden 5 ml der Probe durch Zentrifugation (7200 × g, 10 min) geklärt und der Überstand bei 4 °C mit 0,1 ml Chloroform gelagert.

Wir quantifizierten die Bakteriendichte mit einem Durchflusszytometrie-Assay, der Endosporen von vegetativen Zellen (Nichtsporen) auf der Grundlage der unterschiedlichen Aufnahme des Nukleinsäurefarbstoffs SYBR-Grün unterschied [65]. Wir quantifizierten die Phagendichten mithilfe eines quantitativen PCR-Assays (qPCR) mit SPO1-spezifischen Primern (Tabelle S2) zusammen mit einer Standardkurve, die aus einer Reihenverdünnung des angestammten Phagenlysats mit bekanntem Titer erstellt wurde. Mit den resultierenden Daten haben wir die Haupteffekte der Phagenbehandlung, der Samenbankbehandlung und der Zeit sowie Wechselwirkungen höherer Ordnung unter Verwendung wiederholter Messungen (RM)-ANOVA getestet, implementiert mit einem linearen Mixed-Effects-Modell (R-Paket nlme v3.1). -149 [66]). Um die Annahmen zu erfüllen, haben wir Rohhäufigkeitsdaten mithilfe der Box-Cox-Methode (R-Paketauto v3.0-10 [67]) transformiert. Um den Mangel an Unabhängigkeit bei wiederholten Stichproben von Populationen im Laufe der Zeit zu berücksichtigen, haben wir eine autoregressive Korrelationsstruktur mit gleitendem Durchschnitt (corARMA(p,q)) mit Parametern einbezogen, die auf der Grundlage des Akaike Information Criterion (AIC) ausgewählt wurden. Um Unterschiede zwischen Behandlungskombinationen zu identifizieren, führten wir eine Post-hoc-Analyse auf der Grundlage geschätzter Randmittelwerte des RM-ANOVA-Modells unter Verwendung des emmeans R-Pakets (v1.5.1 [68]) durch. Weitere Einzelheiten finden Sie im Ergänzungstext.

Um zu testen, wie Samenbanken die Entwicklung der Phagenresistenz beeinflussen, haben wir die Anfälligkeit von Bakterien zu verschiedenen Zeitpunkten gegenüber einer Infektion durch den angestammten Phagen charakterisiert. Unser Test umfasste das Aufbringen einer trüben Bakterienkultur mit einem Pin-Replikator auf DSM-Platten, die eine Oberflächenausbreitung des angestammten SPO1 enthielten (Abb. S2). Als Kontrolle haben wir dieselben Klone auf DSM-Platten ohne Phagen entdeckt. Bakterienklone, die auf beiden Platten wachsen konnten, wurden als resistent bewertet, während Klone, die nur in Abwesenheit von Phagen wuchsen, als anfällig bewertet wurden. Wir haben Bakterienklone (n = 22 pro Population), die aus Proben isoliert wurden, die während der ersten vier Transfers des Koevolutionsexperiments konserviert wurden, gegen den angestammten Phagen herausgefordert. Aus der Samenbank wiederbelebte Klone wurden auf die gleiche Weise getestet (n = 22 pro Population). Wir haben die Auswirkungen der Samenbankbehandlung und der Klonherkunft (Gesamtpopulation vs. Samenbank) auf die Entwicklung der Resistenz gegen den angestammten Phagen mithilfe von RM-ANOVA wie oben beschrieben getestet.

Wir führten eine gepoolte Populationssequenzierung durch, um zu bewerten, wie sich die Samenbank und die Phagenbehandlungen auf die molekulare Evolutionsdynamik von Bakterien und Phagenpopulationen auswirkten. Wir extrahierten genomische DNA am Ende der seriellen Transfers 1, 4, 7, 10 und 14 des Koevolutionsexperiments (siehe Ergänzungstext). Paired-End-Bibliotheken wurden mit einer minimalen Zielabdeckung von 100 mit 2 × 38-bp-Reads für Phagen und 2 × 150-bp-Reads für die Bakterien erstellt. Die Sequenzierung wurde mit einem NextSeq500-Sequenzer (Illumina) durchgeführt. Mutationen und ihre Häufigkeit wurden mit breseq [69] im Polymorphismusmodus ermittelt. Um uns auf Mutationen mit dem größten potenziellen Einfluss auf die Fitness zu konzentrieren, haben wir unsere Analysen auf nicht-synonyme Mutationen, Insertionen und Deletionen beschränkt. Mutationshäufigkeitsverläufe über die Zeit wurden nur für Mutationen berücksichtigt, die zu mindestens drei Zeitpunkten nachgewiesen wurden.

Um die Wirkung von Phagen- und Samenbankbehandlungen auf die genetische Vielfalt von Bakterien zu vergleichen, haben wir die Multiplizität (m) jedes Gens in jeder Population berechnet (70). In unserer Implementierung standardisiert Multiplizität die Anzahl der in einem Gen beobachteten Mutationen entsprechend der Genlänge und ermöglicht Vergleiche zwischen Genen und Populationen. Da nur wenige Fixierungsereignisse beobachtet wurden, wogen wir die Genmultiplizität anhand der mittleren Häufigkeit aller Mutationen in diesem Gen, mit Ausnahme von Nullen. Die Multiplizität (m) des i-ten Gens in der j-ten Population ist dann definiert als \(m_{i,j} = \frac{{\bar L}}{{L_i}}\mathop {\sum }\nolimits_{k \in i} f_{med\,j,k}\), wobei Li die Anzahl der nicht-synonymen Stellen im i-ten Gen ist, \(\bar L\) die mittlere Anzahl der nicht-synonymen Stellen unter allen Genen ist und fmed j ,k ist die mittlere Häufigkeit der Mutation k in Gen i in Population j in Bezug auf die Zeit. Um Unterschiede in der Gesamtzahl der in den Populationen erworbenen Mutationen zu berücksichtigen, haben wir m durch die Summe von m für alle Gene normalisiert, \(\tilde m_{i,j} = m_{i,j}/\mathop {\sum } \nolimits_i m_{i,j}.\) Wir haben die Verteilungen der relativen Multiplizität über Behandlungen hinweg mithilfe von Kolmogorov-Smirnov-Tests bei zwei Stichproben mit p-Werten verglichen, die durch Permutation von Behandlungsbezeichnungen erhalten wurden. Zuletzt verglichen wir die Zusammensetzung von Genen mit Mutationen zwischen Behandlungen mithilfe der Hauptkoordinatenanalyse (PCoA) mit Bray-Curtis-Distanz. Wir haben PERMANOVA für die obersten fünf Hauptkoordinaten (was die Variation von >90 % erklärt) mit der Adonis2-Funktion in vegan v2.6-2 [71] mit euklidischem Abstand und 10.000 Permutationen verwendet. Die Ergebnisse der PERMANOVA ermöglichten es uns, die Haupteffekte der Samenbank- und Phagenbehandlungen sowie deren Wechselwirkung auf die Zusammensetzung mutierter Gene zu testen.

Um festzustellen, wie die Koevolution durch eine Samenbank beeinflusst wurde, haben wir die Korrelation zwischen Wirts- und Phagenmutationsverläufen über die Zeit quantifiziert [72]. Wir haben Pearsons Korrelationskoeffizienten zwischen Paaren von Mutationstrajektorien in entsprechenden Wirts- und Phagenpopulationen berechnet. Um einen übermäßigen Einfluss von Nullen zu minimieren, wurden Trajektorienpaare mit weniger als drei Beobachtungen von Nicht-Null-Häufigkeiten sowohl in Wirts- als auch in Phagenpopulationen entfernt. Um Nullverteilungen zu erhalten (d. h. keine Koevolution), haben wir die Zeitmarkierungen der beobachteten Trajektorien zufällig permutiert, bevor wir die Korrelationskoeffizienten berechnet haben, wie oben beschrieben. Alle Vergleiche zwischen Verteilungen wurden mithilfe von Kolmogorov-Smirnov-Tests mit zwei Stichproben und p-Werten durchgeführt, die durch Permutation der Behandlungsbezeichnungen erhalten wurden. Weitere Einzelheiten finden Sie im Ergänzungstext.

Bei der Sporulation kommt es zu Veränderungen an der Zelloberfläche, von denen wir vorhergesagt haben, dass sie die Phagenanhaftung verringern würden. SPO1-Phagen waren nicht in der Lage, an gereinigte Endosporen zu adsorbieren (Abb. 2; t-Test mit einer Probe, t3 = –1,8, p = 0,91). Im Gegensatz dazu produzierten > 66 % der an vegetative Zellen gebundenen SPO1-Phagen vom gleichen Bakteriengenotyp innerhalb der ersten fünf Minuten des Tests (T-Test mit einer Probe, t3 = 15,3, p = 0,0003), was einer Adsorptionsrate von 4,63 entspricht ( ± 3,07) × 10−9 ml−1 min−1.

Wir zeigen, dass der Phagen SPO1 nicht an Endosporen von Wildtyp-Bacillus subtilis binden kann. Die prozentuale Adsorption wurde aus der Abnahme der freien Phagen über 5 Minuten berechnet, wenn sie entweder mit gereinigten Endosporen oder vegetativen Zellen gemischt wurden. Dargestellt sind der Mittelwert (○) und die Standardabweichung von vier biologischen Replikaten (●). Graue Balken zeigen die Untergrenze des 95 %-Konfidenzintervalls eines einseitigen t-Tests für jeden Wirtszelltyp an.

Um zu testen, wie sich das Ruherefugium auf die antagonistische Koevolution auswirkt, führten wir ein serielles Transferexperiment durch, bei dem wir B. subtilis-Wirte mit SPO1-Phagen in Gegenwart oder Abwesenheit einer externen Samenbank herausforderten (Abb. 1). Die Kombination aus Stammgenetik, Wachstumsmedium und Transferregime war wirksam bei der Aufrechterhaltung hoher Sporulationsniveaus im Verlauf des Experiments. Beispielsweise überstieg bei der Behandlung mit Samenbanken die Endosporenhäufigkeit häufig die Häufigkeit vegetativer Zellen zum Zeitpunkt des Transfers (Abb. S3). Die Behandlung mit der Samenbank veränderte die Art und Weise, wie Phagen die Wirtsdynamik beeinflussten (RM-ANOVA; Phagen x Samenbank x Zeit, F28, 224 = 2,2, p = 0,0009, Abb. 3). Ohne eine Samenbank führte die Phageninfektion zu einer 15-fachen Verringerung der Bakterienpopulationsgröße im Vergleich zur nicht infizierten Kontrolle (Post-hoc-Vergleiche basierend auf geschätzten Randmittelwerten der Zeitreihe, t8 = 10,6, p < 0,0001) bei minimalen Wirtsdichten (8,5 × 105) trat früh im Experiment auf (Tag 5). Bei einer Samenbank reduzierte die Phageninfektion die durchschnittliche Populationsgröße im Vergleich zu nicht infizierten Kontrollen nur um das Sechsfache (Post-hoc-Vergleiche basierend auf geschätzten Randmittelwerten der Zeitreihe, t8 = 9,7, p < 0,0001) bei minimalen Wirtsdichten (3,2). × 107), die später im Experiment auftritt (Tag 13). Samenbanken stabilisierten auch phageninduzierte Schwankungen der Wirtsdichte (Post-hoc-Vergleiche basierend auf geschätzten Randmitteln, t268 = 3,0, p = 0,031). Dieser Effekt war zu Beginn des Experiments am stärksten ausgeprägt, als Phagen den größten Einfluss auf die Populationsdichte des Wirts hatten (Abb. S4). In der Mitte des Experiments (Tag 14) wurden phageninduzierte Schwankungen der Bakteriendichte in beiden Samenbankbehandlungen gedämpft. Ohne Phagen hatten Samenbanken keinen Einfluss auf die Bakteriendichte (t8 = 1,2, p = 0,28; Abb. S4), sie erhöhten jedoch die Populationsstabilität während des gesamten Experiments (t268 = 12,5, p < 0,001, Abb. S4).

Die Bakterien- und Phagendynamik wurde in Replikatpopulationen (n = 3) verfolgt, die alle zwei Tage durch seriellen Transfer vermehrt wurden (siehe Abb. 1). Bei der + Samenbankbehandlung konnte der Wirt sporulieren. Bei der Behandlung mit der Samenbank wies der Wirt eine manipulierte Mutation auf, die die Sporulation verhinderte. Phagen SPO1 wurde allen Populationen (Flaschen) in der +-Phagen-Behandlung am Tag 0 hinzugefügt. Siehe Abb. S5, um die Populationsdynamik der verschiedenen Wirtsstämme in den --Phagen- und +-Phagen-Behandlungen zu vergleichen. Daten dargestellt als Mittelwert ± SEM.

Um zu bewerten, wie Samenbanken die Entwicklung der Phagenresistenz beeinflussen, haben wir die Anfälligkeit des Wirts gegenüber dem angestammten Phagen für Bakterien quantifiziert, die im Laufe der Zeit aus Replikatpopulationen isoliert wurden. Bei der Behandlung mit der Samenbank sank die Phagenanfälligkeit schnell auf Frequenzen, die unterhalb der Nachweisgrenze lagen. Zum Zeitpunkt der ersten Übertragung wurden anfällige Wirte durch resistente Bakterien ersetzt, die nahezu 100 % der Population ausmachten und diese Häufigkeit für den Rest des Experiments beibehielten (Abb. 4). Ein ähnlicher Trend wurde bei der + Samenbankbehandlung für Klone beobachtet, die vor dem Transfer aus der Gesamtpopulation (vegetative Zellen + Endosporen) entnommen wurden (RM-ANOVA, F1, 4 = 1,1, p = 0,354). Allerdings unterschied sich die Phagenanfälligkeit in der externen Samenbank deutlich von der der Gesamtpopulation (RM-ANOVA, F1, 14 = 12,5, p = 0,003). Insbesondere waren mehr Klone aus der Samenbank anfällig, als angesichts der Verdünnungsrate der Endosporen aus der Samenbank vor der Infektion zu erwarten wäre (Abb. 4). Dieser Befund legt nahe, dass anfällige Wirte in der Lage waren, sich in Gegenwart von Viren zu vermehren und zu sporulieren, selbst wenn die Wirtspopulation von Phagenresistenz dominiert wurde.

Wir haben die Anfälligkeit quantifiziert, indem wir Klone von Bacillus subtilis gegen den angestammten Phagen getestet haben. Sowohl bei der +-Samenbank- als auch bei der --Samenbank-Behandlung führten wir diesen Test an Klonen (n = 22) durch, die aus jeder in einem Kolben enthaltenen Fokuspopulation (Abb. 1) unmittelbar vor dem seriellen Transfer isoliert wurden (). Darüber hinaus haben wir zu jedem Zeitpunkt Klone (n = 22) aus der externen Samenbank (Abb. 1) wiederbelebt und diese gegen den angestammten Phagen herausgefordert (). Der erwartete Prozentsatz anfälliger Klone () basiert auf Verdünnungsverlusten, die durch den seriellen Transfer von Klonen verursacht werden, die aus der externen Samenbank vor der Infektion stammen (siehe ergänzende Informationen). Daten dargestellt als Mittelwert ± SEM der Replikatpopulationen (n = 3).

Die Verteilung der genetischen Variation des Wirts (dh Allele) in Bakterienpopulationen wurde durch die Behandlung mit der Samenbank erheblich verändert (Abb. 5). Bei der Untersuchung der Genmultiplizität, die sowohl die Anzahl nicht-synonymer Mutationen pro Gen gewichtet nach Genlänge als auch die Häufigkeit von Mutationen berücksichtigt (Abb. 5a), wiesen Populationen, die sich mit einer Samenbank entwickelten, ungefähr doppelt so viele Gene mit Mutationen auf wie solche, die sich entwickelten ohne Samenbank. Die zusätzliche genetische Vielfalt aus der Samenbank führte zu einem längeren Ende der Multiplizitätswerte (Abb. 5b).

a Mutationen wurden durch Sequenzierung identifiziert und den Genen zugeordnet, die sie beeinflussen. Die Multiplizität eines Gens spiegelt die Anzahl der Mutationen wider, die in einem Gen aufgrund seiner Länge beobachtet wurden, und wurde anhand der Häufigkeit dieser Mutationen in der Population gewichtet. Bei gleich langen Genen (Gene A, B und C) kann eine hohe Multiplizität durch eine hohe Mutationshäufigkeit in der Population (Gen A), mehrere mutierte Stellen (Gen B) oder eine Kombination aus beidem entstehen. b Zum Vergleich zwischen Populationen haben wir die relative Multiplizität berechnet, indem wir die Summe der Multiplizitäten in jeder Population auf gleich eins normalisiert haben. Jede Kurve stellt die relative Genmultiplizität dar, sortiert nach abnehmenden Multiplizitätswerten für eine einzelne Population. Durchgezogene Linien stellen Populationen aus der +-Phagen-Behandlung (n = 3) dar, während gestrichelte Linien Populationen aus der –-Phagen-Behandlung (n = 3) darstellen. Der Einfluss von Samenbanken auf die Multiplizitätsverteilung wurde mithilfe eines permutationellen Kolmogorov-Smirnov-Tests bestimmt.

Der Einfluss der Samenbank auf die genetische Vielfalt spiegelte sich auch in der Zusammensetzung bakterieller Gene mit Mutationen wider. Mehr als 70 % der Allelvariation in der Population konnten der Samenbank zugeschrieben werden (Abb. S6. PERMANOVA F1,8 = 65,3, p < 0,0001). Samenbanken behielten Allelvarianten von Genen bei, die an einer Vielzahl von Funktionen beteiligt waren (Tabelle S3, Ergänzungstext). Beispielsweise korrelierten Gene, die im Ordinationsdiagramm der Wirtsmutationen signifikant mit der Samenbankbehandlung korrelierten, mit der Stressreaktion (z. B. fluC, yhdN, yceH), der Zellwandsynthese (z. B. dacA, ylmD) und der Regulierung der Genexpression (z. B. yrdQ). Im Gegensatz dazu hatte die Samenbankbehandlung keinen Einfluss auf die Verteilung allelischer Varianten (Abb. S7) oder auf die Zusammensetzung mutierter Gene (Abb. S8) in Phagenpopulationen.

Phagen beeinflussten auch die Zusammensetzung der Wirtsmutationen (Abb. 6 und S6, PERMANOVA F1,8 = 6,1, p = 0,022). Fast alle Mutationen, die in phageninfizierten Populationen eine hohe Häufigkeit (> 0,3) erreichten, betrafen Gene, die an der Teichonsäure-Biosynthese beteiligt sind. Teichonsäure ist ein Polymer, das in der Zellwand grampositiver Bakterien vorkommt und vom Phagen SPO1 zur Anlagerung verwendet wird [61]. Alle Replikatpopulationen in der +-Phagenbehandlung wiesen hochfrequente Mutationen in mindestens einem von vier Genen (pcgA, tagD, tagF und gtaB) im Teichonsäureweg auf (Abb. 6 und S9). Davon traten tagD- und pcgA-Mutationen unabhängig voneinander in getrennten Populationen auf und korrelierten im Ordinationsdiagramm der Wirtsmutationen signifikant mit einer Phageninfektion (Tabelle S3). Neben pcgA-Mutationen wiesen alle Populationen mit einer Samenbank, die mit Phagen infiziert waren, häufig Mutationen im sinR-Repressor der Biofilmbildung auf. In Abwesenheit von Phagen wiesen alle Populationen hochfrequente Mutationen in einem einzelnen Gen (oppD) des opp-Oligopeptid-Transportersystems auf, und vier von sechs Populationen wiesen hochfrequente Mutationen in der Phosphorelay-Kinase kinA auf (Abb. S9). Ohne eine Samenbank wiesen die Wirte eine größere Anzahl hochfrequenter Mutationen auf, darunter mehrere Gene des opp-Operons und in resE, einer Sensorkinase, die die aerobe und anaerobe Atmung reguliert. Hochfrequente Mutationen in den Phagenpopulationen traten unabhängig von der Samenbankbehandlung überwiegend in Genen auf, die für Schwanzstrukturgene kodieren (gp15.1, gp16.2, gp18.1, gp18.3) (Abb. 6). Frühere Arbeiten mit B. subtilis haben gezeigt, dass die durch Mutationen in gtaB verursachte Resistenz gegen SPO1 durch Mutationen in den Schwanzfasergenen gp18.1, gp18.3 sowie gp16.2 überwunden werden kann (61).

Die Häufigkeitsverläufe mutierter Allele in phageninfizierten Gemeinschaften (a) ohne Samenbank und (b) mit Samenbank. Jede Zeile zeigt die Daten für den Wirt und den Phagen einer einzelnen Gemeinschaft (Zahlen auf der rechten Seite). Nicht-synonyme Mutationen, die eine Häufigkeit von >0,3 erreichen, werden durch das Gen gefärbt, in dem sie aufgetreten sind. Für jede Population werden die Namen der Gene mit Hochfrequenzmutationen angegeben. Einzelheiten zu Genen finden Sie in Tabelle S4. c Bei der Samenbankbehandlung war die Verteilung der Korrelationskoeffizienten zwischen Wirts- und Phagenmutationsverläufen im Vergleich zu einer Nullverteilung, die durch Permutation von Zeitmarkierungen erhalten wurde, negativ verzerrt. Bei der + Samenbank-Behandlung ähnelte die Verteilung der der Null mit einem leichten Überangebot an Paaren mit niedriger Korrelation, was mit der Pufferung der Koevolutionsdynamik von Wirt und Phagen durch die Samenbank übereinstimmt.

Um festzustellen, wie die Koevolution durch eine Samenbank beeinflusst wurde, haben wir die Korrelation zwischen den Verläufen von Wirts- und Phagenmutationen im Zeitverlauf quantifiziert [72]. Wenn Wirt und Phagen sich gegenseitig eine gegenseitige Selektion aufzwingen würden, würden wir erwarten, dass es eine starke Korrelation zwischen den segregierenden Mutationen der beiden Populationen gibt. Ohne eine Samenbank gab es im Vergleich zu einer durch Permutation erhaltenen Nullverteilung eine Überfülle an negativen Korrelationen (Abb. 6c). Bei einer Samenbank unterschied sich die beobachtete Verteilung der paarweisen Korrelationen immer noch erheblich von der Nullverteilung, aber ihre Form verzerrte sich nicht zu einer Seite, sondern ähnelte insgesamt eher der einheitlichen Form der Nullverteilung (Abb. 6c). Die Verteilungen der paarweisen Korrelationen zwischen Wirts- und Phagenmutationsverläufen mit und ohne Samenbank unterschieden sich signifikant voneinander (Kolmogorov-Smirnov-Test, D = 0,151, p < 0,0001). Zusammenfassend zeigt unsere Analyse, dass die Korrelationen zwischen Phagen- und Wirtsmutationsverläufen durch die Samenbank geschwächt wurden, was mit einer durch die Ruhephase gedämpften Koevolutionsdynamik vereinbar ist.

Wir haben experimentell getestet, wie Samenbanken die koevolutionäre Dynamik zwischen Bakterien und Phagenpopulationen beeinflussen, indem sie die Endosporulation manipulieren, ein Ruhemerkmal, das wichtige Auswirkungen auf die Persistenz und Ausbreitung von Bakterien in wirtsassoziierten Ökosystemen und Umweltökosystemen hat. Durch die Veränderung der Adsorptionsraten und die Schaffung einer Samenbank reduzierte die Sporulation die mit einer Phageninfektion verbundene Bakteriensterblichkeit. Dies wiederum pufferte die Populationsdynamik, konservierte Phagen-anfällige Phänotypen und behielt niedrigfrequente Mutationen in den Wirtspopulationen bei. Sowohl in Wirts- als auch in Phagenpopulationen kam es wiederholt zu hochfrequenten Mutationen in Genen, von denen bekannt ist, dass sie Ziele der Selektion sind. Durch die Analyse von Mutationsverläufen legen unsere Daten nahe, dass Samenbanken physischen Schutz und biologisches Gedächtnis bieten [17], was die Stärke der antagonistischen Koevolution zwischen Bakterien und Phagenpopulationen dämpfen kann.

Sporulation ist ein komplexes Merkmal, das es Bakterien ermöglicht, in schwankenden Umgebungen zu überleben. Wir haben gezeigt, dass die Sporulation auch einen Schutz vor einer Phageninfektion bietet. Der Phagen SPO1 konnte sich wahrscheinlich aufgrund von Veränderungen der Zelloberfläche der Sporen nicht an Endosporen binden (Abb. 2). Endosporen sind in Proteinen eingeschlossen, die die Rezeptoren maskieren können, die Phagen zum Erkennen und Anheften an die Wirtszelle verwenden. Darüber hinaus schützt dieser Sporenmantel die Zellwand vor lytischen Enzymen [28], wie sie beispielsweise von vielen Phagen für den Eintritt in die Wirtszelle verwendet werden [73]. Obwohl die Sporulation vorübergehend ist, bietet sie einige Vorteile im Vergleich zu anderen Formen der Phagenabwehr. Beispielsweise kann es dem Wirt ermöglichen, die mit Phagenresistenzmutationen verbundenen Kosten zu vermeiden und gleichzeitig einen umfassenden Schutz gegen mehrere oder möglicherweise alle Phagen zu bieten. Der Schutz wird wahrscheinlich durch eine inkompatible Bindung gewährleistet, aber auch durch die physische Herausforderung, die mit dem Eindringen in die dicke Sporenhülle verbunden ist [47, 74, 75]. Wir konnten eine Abwehr gegen Phagen nachweisen (Abb. 2), aber der Schutz könnte noch weiter reichen, da einige Raubtiere (z. B. Protisten) nicht in der Lage sind, Endosporen zu verdauen [28]. Diese oft übersehenen Merkmale könnten erklären, warum sporenbildende Bakterien einer der am häufigsten vorkommenden Zelltypen auf der Erde sind [76]. Der Zufluchtsort der Samenbank ist jedoch nicht auf die Endosporulation beschränkt. Andere Formen der Ruhephase sorgen ebenfalls für Resistenz gegen Krankheitserreger und Fressfeinde, einschließlich Ruhestadien von Bakterien, Algen, Pflanzen und Metazoen [55, 77,78,79,80].

Phagen üben einen starken Top-Down-Druck auf Bakterien aus, der häufig zu komplexen ökoevolutionären Dynamiken führt [8, 81]. Innerhalb eines einzigen Transfers nach der Infektion breitete sich die Phagenresistenz in den Wirtspopulationen aus (Abb. 3), wie es häufig in Koevolutionsstudien im Labor beobachtet wird (z. B. 4). Beim ersten Transfer gab es jedoch in keiner der infizierten Populationen einen einzelnen Genotyp, der die Wirtspopulationen dominierte (Abb. 6). Somit wurde die phänotypische Reaktion auf die starke Selektion durch Phagen durch genetische Diversifizierung erreicht, die erst später beseitigt wurde, als bestimmte Genotypen in der Wirtspopulation fixiert wurden. Unabhängig von seiner genetischen Basis ermöglichte die schnelle Entwicklung der Phagenresistenz Bacillus, sich am Ende des ersten Transfers zu erholen und Dichten zu erreichen, die mit nicht infizierten Populationen vergleichbar waren (Abb. S5). Trotz der geringen Häufigkeit empfindlicher Wirte blieb die Größe der Phagenpopulationen hoch. Eine Erklärung für dieses Muster ist, dass sich Phagenmutanten entwickelten, die resistente Bakterien infizieren konnten. Um dies zu untermauern, dokumentierten wir einen Anstieg der Häufigkeit von Mutationen im Zusammenhang mit Wirtsrezeptoren (Teichonsäuren) sowie Phagenschwanzkomponenten, die an der Resistenzbrechung beteiligt sind [61]. Zusammengenommen sind die in unserer Studie festgestellten Mutationen mit typischen Zielen der Koevolution verbunden (38, 44).

Samenbanken veränderten die Wirt-Phagen-Dynamik erheblich. Nach dem zweiten Transfer verringerte sich die Größe der infizierten Wirtspopulation deutlich, ein Effekt, der für den Rest des Experiments anhielt (Abb. 3). Ohne eine Samenbank führte eine Phageninfektion zu einer größeren und schnelleren Verringerung der Bakteriendichte. Dieser Phageneffekt war in Gegenwart einer Samenbank viel weniger ausgeprägt, was höchstwahrscheinlich auf die geringere Sterblichkeit pro Kopf zurückzuführen ist, die durch unverwundbare Endosporen in der Wirtspopulation verursacht wird. Darüber hinaus stabilisierte die Samenbank wahrscheinlich Bakterienpopulationen, die während der seriellen Passage schwankenden Ressourcenbedingungen ausgesetzt waren. Nach jedem Transfer keimten die meisten Endosporen. Als ungeschützte und aktive Zellen wurden diese Individuen anfälliger für eine Phageninfektion. Vor der Übertragung am nächsten Tag würde die Erschöpfung der Ressourcen als Anhaltspunkt für die Einleitung der Sporulation dienen. Bei der Behandlung mit +-Phagen führte dies zu Endosporendichten, die denen vegetativer Zellen entsprachen oder diese übertrafen (Abb. S3). Solche Ergebnisse stehen im Einklang mit Vorhersagen, dass ein Zufluchtsort in Form einer unverwundbaren Beute die Amplitude der Räuber-Beute-Zyklen verringern kann [75, 82, 83, 84].

Während die Sporulation für Bacillus als Phagenabwehr von Vorteil ist, deuten unsere Ergebnisse etwas kontraintuitiv darauf hin, dass sie auch die Persistenz von Phagenpopulationen fördern könnte. In der Samenbank erreichten anfällige Wirte über einen längeren Zeitraum höhere Frequenzen (Abb. 4). Die Wiederbelebung anfälliger Wirte sollte eine stärkere Phagenreproduktion ermöglichen und Verluste durch Auswaschen und Partikelzerfall ausgleichen. Darüber hinaus besteht bei fehlender Samenbank ein höheres Risiko, dass seltene anfällige Wirte lokal aussterben, insbesondere wenn es zu starken Engpässen kommt (z. B. serielle Übertragungsereignisse) [85, 86]. Infolgedessen unterstützen Samenbanken möglicherweise tatsächlich die Erzeugung der Phagendiversität, die für die Koevolution von entscheidender Bedeutung ist. Tatsächlich ist es wahrscheinlicher, dass Resistenz-brechende Mutanten in einer Population entstehen, die sowohl resistente als auch anfällige Wirte enthält [87, 88]. Insgesamt können Samenbanken durch die Stabilisierung von Wirtspopulationen und die Aufrechterhaltung einer Subpopulation empfindlicher Wirte die Koexistenz von Wirt und Parasit fördern, teilweise durch die Entstehung von Phagenmutanten, die für die Koevolution erforderlich sind.

Im Einklang mit den Erwartungen zeigten unsere Experimente, dass Samenbanken die genetische Vielfalt bewahren. Die Anzahl der Gene, für die wir Allelvarianten entdeckten, war in Populationen, die über eine Samenbank verfügten, etwa doppelt so hoch, unabhängig davon, ob sie mit Phagen infiziert waren oder nicht (Abb. 5). Da unsere Populationen aus einzelnen Kolonien initiiert wurden, muss die beobachtete genetische Vielfalt des Wirts im Verlauf des Experiments de novo erzeugt worden sein. Die erhöhte Anzahl mutierter Gene bei der + Samenbank-Behandlung war nicht einfach eine Folge einer größeren Bakterienpopulation, was durch die Tatsache belegt wird, dass die Bakteriendichten bei beiden Phagenbehandlungen ähnlich waren (Abb. S5). Ebenso kann der Unterschied in mutierten Genen nicht auf eine phagenbeschleunigte Diversifizierung zurückgeführt werden [89], da der Effekt der Samenbank auf die Diversität in infizierten und nicht infizierten Wirtspopulationen beobachtet wurde. Unsere Ergebnisse stimmen vielmehr mit einem genetischen Speichereffekt überein, bei dem seltene Allele, die andernfalls durch genetische Drift oder negative Selektion verloren gegangen wären, in der Bakterienpopulation erhalten blieben. Die hier auf Populationsebene aufgezeichnete Auswirkung auf die Diversität entspricht den Erwartungen eines erhöhten Artenreichtums und einer erhöhten Artenseltenheit in Gemeinschaften mit einer Samenbank, was vermutlich die in mikrobiellen Systemen beobachtete Verteilung der Artenhäufigkeit mit langem Schwanz erklärt (17, 90). Während die Erhaltung der genetischen Vielfalt nicht auf die Dynamik der Phageninfektion zurückzuführen ist, hat sie Konsequenzen für die Koevolution von Bakterien und Phagen. Erstens kann eine erhöhte Wirtsvielfalt die Ausbreitung einer Parasitenpopulation behindern [91, 92]. Zweitens kann die Vielfalt der Beute Rückkopplungen hervorrufen, die sich auf die Dynamik und Stabilität von Raubtieren und ihrer Beute auswirken [93]. Insgesamt können Samenbanken durch die Bereitstellung eines Zufluchtsorts vor Parasiten die Dynamik stabilisieren und die Diversität einer Wirtspopulation erhöhen, was direkte Auswirkungen auf die Koevolution hat.

In einer Gemeinschaft koevolvierender Bakterien und Phagen sollte die gegenseitige Selektion im Laufe der Zeit zu Korrelationen zwischen Phagen- und Wirtsgenotypen führen. Ohne eine Samenbank stellten wir fest, dass die Beziehung zwischen abgeleiteten Wirts- und Phagen-Allelen zu einer verzerrten Verteilung mit starken negativen Korrelationen führte (Abb. 6c). Bei einer Samenbank war die Korrelation zwischen segregierenden Allelen in den Phagen- und Wirtspopulationen deutlich schwächer. Eine solche Entkopplung spiegelt wahrscheinlich die Dämpfung der Phagenselektion bei Wirtsvarianten aufgrund der Samenbank-Zuflucht wider. Allerdings haben Samenbanken auch das Potenzial, die Evolution zu beschleunigen, indem sie seltenen Varianten aus der Vergangenheit die Wiederbelebung unter Bedingungen ermöglichen, an die sie besser angepasst sind [94], was eine Form des biologischen Gedächtnisses darstellt. Beispielsweise können Wirtsresistenzmutationen bei niedriger Häufigkeit lauern, bevor sie ansteigen und den Verlauf der Bakterien-Phagen-Koevolution verändern [95]. Wenn diese sogenannte „Leapfrog-Dynamik“ auftritt, schreitet die Koevolution durch den gelegentlichen Austausch dominanter Wirts- und Parasiten-Genotypen voran. In vielen laborbasierten Evolutionsstudien führt die wechselseitige Selektion zwischen Wirten und Phagen zu einem Wettrüsten, das von harten Auseinandersetzungen begleitet wird, die zur Fixierung führen [38, 39, 89]. Im Laufe der Zeit wird diese ökoevolutionäre Dynamik tendenziell weniger ausgeprägt, da die Populationen sich diversifizieren und Kompromisse im Zusammenhang mit Widerstand und Gegenwiderstand eingehen [46, 96, 97]. Samenbanken bieten ein weiteres Mittel zur Aufrechterhaltung der Diversität, das Bakterien-Phagen-Wechselwirkungen puffern kann, basierend auf unserer Beobachtung einer stabilisierten Dynamik (Abb. 3) und gedämpfter Korrelationen von Mutationsverläufen (Abb. 6). Zukünftige Bemühungen zur Aufklärung des Nettoeffekts von Samenbanken auf die Koevolution sollten phänotypische Daten isolatbasierter Infektionsnetzwerke mit der Genomanalyse der Wirts- und Parasitenpopulationen kombinieren.

Mithilfe externer Samenbanken können andere ökologische und evolutionäre Phänomene erforscht werden, die entstehen, wenn eine Population sich überschneidende Generationen aufweist. Wichtige Merkmale einer Samenbank, einschließlich Größe und Altersstruktur, können durch Veränderung der Probenvolumina und Mischungsverhältnisse der externen Samenbank erreicht werden. Der Ansatz ist zwar für den Einsatz mit Mikroorganismen anwendbar, eignet sich jedoch im Prinzip für den Einsatz bei jeder Gruppe von Taxa, bei denen Individuen in einem suspendierten Stoffwechselzustand konserviert werden können, beispielsweise durch Kryokonservierung oder Lyophilisierung. Solche Strategien können die Gestaltung von Experimenten ermöglichen, um Theorien zu testen, die komplexe Lebensgeschichten mit Demographie und Evolution integrieren (z. B. [94]). Da dieser Ansatz bisher noch nicht umgesetzt wurde, war unser Experiment darauf ausgelegt, grundlegende Erwartungen der Samenbanktheorie auf kontrollierte und replizierte Weise zu testen. Infolgedessen wurden viele der Komplexitäten von Samenbanken und Koevolution, die in Umgebungen wie Eingeweiden oder Böden üblich sind, in der aktuellen Studie nicht explizit erfasst. Dennoch weist die externe Samenbank Ähnlichkeiten mit natürlich vorkommenden Samenbanken auf, bei denen ruhende Individuen an Stellen leben, die sich räumlich von metabolisch aktiven Individuen unterscheiden, wie etwa Pflanzensamen in Böden oder Phytoplanktonzysten in Sedimenten [98,99,100].

Experimente wie die hier beschriebenen könnten ausgeweitet werden, um andere Fragen im Zusammenhang mit der Evolutionsökologie von Samenbanken zu untersuchen. Beispielsweise ist das Saatgutbanking nicht auf Wirtspopulationen beschränkt. Auch Parasiten mit Ruhestadien kommen häufig vor, und in manchen Systemen bilden sowohl Wirte als auch Parasiten Samenbanken. Darüber hinaus könnte die Samenbanktheorie zum Verständnis der Kompromisse zwischen Reproduktion und Überleben im Zusammenhang mit Formen der Virusruhe wie Lysogenese und Latenz genutzt werden. Es bedarf weiterer Arbeit, um sich mit der Komplexität auseinanderzusetzen, die unter solchen Bedingungen entstehen kann, aber die bestehende Theorie legt nahe, dass die Ruhephase in Wirt-Parasit-Systemen eine Rückwirkung auf die Entwicklung des Saatgutbankings selbst haben kann [34]. Beispielsweise könnte in unserem Studiensystem der Zufluchtsort der Samenbank zur Aufrechterhaltung der Endosporulation beitragen, einem komplexen Merkmal, an dem Hunderte von Genen beteiligt sind. Wenn sporenbildende Bakterien über viele Generationen hinweg in günstigen Umgebungen gehalten werden, treffen zufällige Mutationen letztendlich wesentliche Sporulationsgene und führen zum Verlust dieser Eigenschaft [53, 101]. Schließlich gibt es zunehmend Hinweise darauf, dass die Ruhephase mit der Ausbreitung interagieren kann, indem sie die Bewegung und Besiedlung von Organismen in räumlich variablen Landschaften erleichtert [102]. Experimente wie die hier beschriebenen würden eine Möglichkeit bieten, solche Ideen zu testen, was für das Verständnis von Epidemien und Krankheitsdynamiken in komplexeren Situationen wichtig wäre [17].

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Ruhe eine lebensgeschichtliche Strategie ist, die im gesamten Lebensbaum weit verbreitet ist. Es kann zur Bildung einer Samenbank führen, die einer Population Struktur und Gedächtnis verleiht. Infolgedessen verändern Saatgutbanken Demografie und Vielfalt auf eine Weise, die die Populationen vor ungünstigen und schwankenden Umweltbedingungen schützt. Samenbanken verändern auch die Interaktionen zwischen Individuen verschiedener Arten, was Auswirkungen auf die wechselseitige und antagonistische Dynamik hat. Unsere Studie hat gezeigt, dass Samenbanken einen Zufluchtsort schaffen können, der die Wirtspopulationen stabilisiert, wenn sie durch Phagen angegriffen werden. Der durch die Ruhephase gebotene Schutz kann die genetische und phänotypische Vielfalt der Wirtspopulationen bewahren, was Auswirkungen auf das ökoevolutionäre Feedback hat. Es gibt jedoch Hinweise darauf, dass Parasiten die Ruhephase von Bakterien auf eine Weise ausnutzen können, die die Fortpflanzungs- oder Überlebenskomponenten der Fitness verbessert [31, 103, 104, 105]. Beispielsweise können Phagen Sporulationsgene erwerben, was darauf hindeutet, dass die Ruhephase eine wichtige Rolle bei der Koevolution von Bakterien und Phagen spielen könnte [56, 57]. Ähnliche Untersuchungen in anderen Studiensystemen werden dazu beitragen, das Ausmaß aufzudecken, in dem Samenbanken den Koevolutionsprozess beeinflussen.

Sequenzdaten sind auf NCBI SRA (BioProject PRJNA932315) verfügbar. Code und Daten zur Reproduktion aller Analysen sind auf Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.7786196) sowie auf GitHub (https://github.com/LennonLab) in den folgenden Repositories verfügbar: coevolution-ts , coevo-seedbank-seq, coevo-seedbank-ancestors und Phage_spore_adsorption.

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Referenzen herunterladen

Wir danken Brent Lehmkuhl und Emily Long für technische Unterstützung; Daniel Kearns und Felix Dempwolff für Stämme; und Nathan Wisnoski für konstruktives Feedback zu einer früheren Version des Manuskripts. Die Forschung wurde von der National Science Foundation (DEB-1934554 an JTL, DAS, JSW; DBI-2022049 an JTL; DEB-1934586 an JSW, DBI-2010885 an WRS) und dem US Army Research Office Grant (W911NF-14-1-) unterstützt. 0411, W911NF-22-1-0014, W911NF-22-S-0008 an JTL) und die National Aeronautics and Space Administration (80NSSC20K0618 an JTL). JSW wurde teilweise durch das Chaires Blaise Pascal-Programm der Region Île-de-France unterstützt.

Abteilung für Biologie, Indiana University, Bloomington, Indiana, IN, USA

Daniel A. Schwartz und Jay T. Lennon

Das Abdus Salam International Center for Theoretical Physics (ICTP), Triest, Italien

William R. Schuhmacher

School of Biological Sciences, Georgia Institute of Technology, Atlanta, GA, USA

Andreea Măgălie & Joshua S. Weitz

Interdisziplinäres Graduiertenprogramm in quantitativen Biowissenschaften, Georgia Institute of Technology, Atlanta, GA, USA

Andreea Măgălie

Fakultät für Physik, Georgia Institute of Technology, Atlanta, GA, USA

Joshua S. Weitz

Institut für Biologie, Ecole Normale Supérieure, Paris, Frankreich

Joshua S. Weitz

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DAS, AM, JSW, JTL entworfene Studie; DAS sammelte Daten; DAS, WRS, JTL analysierten Daten; DAS, WRS, JTL haben den ersten Entwurf des Papiers geschrieben; Alle Autoren haben zur Bearbeitung und Überarbeitung des Manuskripts beigetragen.

Korrespondenz mit Jay T. Lennon.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Schwartz, DA, Shoemaker, WR, Măgălie, A. et al. Bakterien-Phagen-Koevolution mit einer Samenbank. ISME J (2023). https://doi.org/10.1038/s41396-023-01449-2

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Eingegangen: 08. März 2023

Überarbeitet: 25. Mai 2023

Angenommen: 30. Mai 2023

Veröffentlicht: 07. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41396-023-01449-2

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