Die Beziehungen zwischen Mikrobiomvielfalt und Epidemiologie bei heimischen Malariaarten

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 9081 (2023) Diesen Artikel zitieren

3 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Die Mikrobiota der Mücke spielt eine wichtige Rolle für ihr Verhalten und ihre Vektorkompetenz. Die Zusammensetzung ihres Mikrobioms wird stark von der Umwelt, insbesondere ihrem Lebensraum, beeinflusst. Die Mikrobiomprofile erwachsener weiblicher Anopheles sinensis-Mücken aus Malaria-Hyperendemie- und -Hyperendemiegebieten in der Republik Korea wurden mithilfe der 16S-rRNA-Illumina-Sequenzierung verglichen. In verschiedenen epidemiologischen Gruppen waren die Alpha- und Beta-Diversitätsanalysen signifikant. Der wichtigste Bakterienstamm waren Proteobakterien. Die am häufigsten vorkommenden Arten im Mikrobiom hyperendemischer Mücken waren die Gattungen Staphylococcus, Erwinia, Serratia und Pantoea. Insbesondere wurde im hypoendemischen Gebiet ein ausgeprägtes Mikrobiomprofil identifiziert, das durch die Dominanz von Pseudomonas synxantha gekennzeichnet ist, was auf einen möglichen Zusammenhang zwischen den Mikrobiomprofilen und der Häufigkeit von Malariafällen schließen lässt.

Malaria, die durch den einzelligen Parasiten Plasmodium verursacht wird, der Mücken und Menschen infiziert, überträgt die Infektion durch den Stich von Plasmodium-infizierten Anophelinmücken auf ihre Säugetierwirte1. Im Allgemeinen werden derzeit Impfstoffe wie Mosquirix gegen Malaria der Öffentlichkeit angeboten2. Dennoch müssen die wirtschaftlichen Kosten des Impfstoffs berücksichtigt werden. Anschließend konzentrieren sich die meisten Interventionsbemühungen auf die Bekämpfung der Mückenpopulationen, typischerweise durch den Einsatz chemischer Pestizide. Der missbräuchliche Einsatz mehrerer chemischer Pestizide führte zu Resistenzen in Mückenpopulationen3, was den Einsatz alternativer Mückenbekämpfungsstrategien einschließlich der Manipulation des Mückenmikrobioms4,5,6 erforderte.

Das Mikrobiom ist ein Ökosystem kommensaler, symbiotischer und pathogener Bakterien, die mit einem Wirt interagieren7. Mücken enthalten als natürliche Wirte auch eine Vielzahl von Mikroorganismen, darunter Bakterien, Pilze und Viren8. Unter diesen interagieren Bakterien ständig mit Mücken9,10,11 und beeinflussen die Ernährung, Entwicklung, Immunität und das Verhalten der Wirtsmücken. Beispielsweise verhindert eine Infektion mit dem bakteriellen Endosymbionten Wolbachia pipientis zahlreiche Arbovirus-Infektionen12,13. Tatsächlich erwies sich die Einführung des wMel-Stamms von Wolbachia pipientis in die Aedes aegypti-Population als wirksam bei der Reduzierung der Inzidenz von symptomatischem Dengue-Fieber und der Fälle von Krankenhausaufenthalten aufgrund von Dengue-Fieber14. Darüber hinaus ist Chromobacterium sp. Die Exposition führt zu einer hohen Sterblichkeit bei Larven und erwachsenen Mücken und verringert die Anfälligkeit der Mücken für Malaria- und Dengue-Infektionen15, was darauf hindeutet, dass spezifische Mikrobiota in Mücken die Anfälligkeit für Krankheitsinfektionen verändern können16.

Neben physiologischen Wechselwirkungen ist die Bakterienzusammensetzung von Mücken, die in natürlichen Lebensräumen gesammelt werden, je nach geografischer Herkunft und Ökologie sehr unterschiedlich17,18,19,20. Kürzlich zeigten im Feld gesammelte Anopheles-Mücken ein höheres Maß an Heterogenität zwischen Mücken in der Zusammensetzung der Gemeinschaft21. Eine gründliche Untersuchung der Zusammenhänge zwischen regionaler Malariainzidenz und Mikrobiomprofilen fehlt jedoch noch. Diese Studie präsentiert eine vergleichende Analyse der Mikrobiomprofile von Anopheles sinensis-Mücken, die aus malaria-endemischen und malariafreien Gebieten in der Republik Korea (ROK) gesammelt wurden. Plasmodium vivax-Malaria in Südkorea wurde 1979 von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) offiziell ausgerottet22. Allerdings trat Malaria 1993 in einer Region an der Grenze zu Nordkorea erneut auf, wo jedes Jahr 300–500 Malariafälle gemeldet werden23. Es ist immer noch unklar, ob das Wiederauftreten von Malariafällen auf bestimmte natürliche Lebensräume und die weiträumige Migration aus Malaria-Hyperendemiegebieten aus nördlichen Regionen zurückzuführen ist. Die Malaria-Inzidenz ist in Grenzregionen höher als in anderen Gebieten, was auf Faktoren wie den eingeschränkten Zugang zur Gesundheitsversorgung, die Neigung marginalisierter Gruppen – die im Allgemeinen in Grenzregionen leben –, sich behandeln zu lassen, und Schwierigkeiten bei der Verbreitung von Präventionsinitiativen in schwer erreichbaren Bevölkerungsgruppen24 zurückzuführen ist . Es wird schwierig sein, Malaria in Grenzregionen auszurotten, aber eine verbesserte Überwachung ist der Schlüssel, um die Quelle neuer Importe oder Wiederansiedlungen zu finden. Daher müssen die Mikrobiomprofilmuster von Mücken in verschiedenen Regionen verglichen und analysiert werden, um Malariaausbrüche zu überwachen. Daher liegt der Schwerpunkt dieser Studie auf der Identifizierung der mikrobiellen Diversität in weiblichen An. sinensis-Mücken aus malariafreien oder hypoendemischen Gebieten und hyperendemischen Gebieten, in denen sporadische Malariafälle gemeldet wurden. Mithilfe der Metagenomikanalyse untersucht diese Studie, ob An. sinensis in Malaria-Endemiegebieten besitzen unterschiedliche Mikrobiomprofile.

Insgesamt 60 erwachsene weibliche An. Sinensis-Mücken wurden aus 12 verschiedenen Gebieten in ganz Korea gesammelt (5 Mückenproben pro Gebiet) (Abb. 1). Von jeder Mücke wurden Mitteldarm und Speicheldrüsen präpariert und anschließend DNA extrahiert. Aus 24 Proben wurden insgesamt 1.936.902 Sequenzen generiert. Die durchschnittliche Anzahl der Rohsequenz-Lesevorgänge betrug 80.704 (zwischen 29.566 und 97.799 Lesevorgänge).

Sammelstelle für Mücken Die Sammelstellen für Mücken wurden anhand der Häufigkeit von Malariafällen ausgewählt. Die Anzahl der Malariapatienten pro 100.000 wurde zur Unterscheidung von hyperendemischen (HyperE) und hypoendemischen (HypoE) Gebieten herangezogen. Die Sammelstellen wurden anhand von Statistiken über Malariapatienten ermittelt. Die Analyse könnte den Lebensraum oder die Ökologie falsch berücksichtigt haben, da nicht jede Region ökologisch analysiert wurde. Die hypoendemischen Gebiete 1 und 2 wurden als Gebiete in der Nähe des hyperendemischen Gebiets unter den Orten ausgewählt, an denen keine Malaria auftrat, um die Auswirkungen der Epidemiologie und nicht der geografischen Merkmale des Mikrobiomprofils von Mücken zu bewerten (HyperE-1: 348-19, Daemari Myojang-ro , Cheorwon-eup, Cheorwon-gun, Gangwon-do HyperE-2: 439-3 Guam-ri, Nam-myeon, Yanggu-gun, Gangwon-do HyperE-3: 31, Dodaero 12beon-gil, Daegwang-ri, Sinseo -myeon, Yeoncheon-gun, Gyeonggi-do HyperE-4: JSA Daeseong-dong Civil Service Class, Josan-ri, Gunnae-myeon, Paju-si, Gyeonggi-do HyperE-5: 119, Tongilchon-gil, Baekyeon-ri , Gunnae-myeon, Paju-si, Gyeonggi-do HyperE-6: 10, Samsanbuk-ro 437beon-gil, Seokmori, Samsan-myeon, Ganghwa-gun, Incheon HyperE-7: 134 Yeonmijeong-gil, Wolgot-ri, Ganghwa -eup, Ganghwa-gun, Incheon HyperE-8: 83-23, Yulsaeng-ro, Daegot-myeon, Gimpo-si, Gyeonggi-do HypoE-1: 564 Cheongna-dong, Seo-gu, Incheon HypoE-2: 283 -2, Sinjeop-ri, Buknae-myeon, Yeoju-si, Gyeonggi-do HypoE-3: Berg 110, Seonyo-ri, Sangju-si, Gyeongsangbuk-do HypoE-4: 36, Hakdong-gil, Suncheon-si, Jeollanam-do).

Anschließend wurden Metriken der Alpha-Diversität bewertet. (Ergänzende Informationen 1). Zur Analyse der mikrobiellen Gemeinschaften wurde Alpha-Diversität verwendet. Zur Messung der Alpha-Diversität wurde der Shannon-Index verwendet. Der höchste Shannon-Diversitätsindex war hypoendemisch 3 Mitteldarm (M) (3,27), gefolgt von hyperendemisch 6M (2,32) und hypoendemisch 2 Speicheldrüsen (S) (2,29). Die Alpha-Diversität aller anhand der Shannon-Diversität bewerteten Proben wurde nach Organ und Epidemiologie analysiert (Abb. 2). Es gab signifikante Unterschiede zwischen hyperendemischen und hypoendemischen Gebieten.

Paarweise Alpha-Diversitätsvergleiche des Mikrobioms von An. sinensis aus verschiedenen Arten von (A) Organen und (B) Epidemiologie. Ein Vergleich der Shannon-Diversität in hyperendemischen und hypoendemischen Gebieten ergab signifikante Unterschiede (H = 10,53, p-Wert = 0,001, q-Wert = 0,001). Für diese Vergleiche wurden Kruskal-Wallis-Tests mit Benjamini-Hochberg-FDR-Korrektur verwendet (q-Wert). Das Signifikanzniveau wurde auf \(\hbox {q}<0,05\) festgelegt, wobei n = die Anzahl der verarbeiteten Proben ist und jeder Pool 5 einzelne Mücken enthält.

Die Mikrobiomprofile von Mücken wurden auf Stamm- und Gattungsebene für jede Region und jedes Organ dargestellt (Abb. 3). Am dominantesten waren Proteobacteria (74,52 %), gefolgt von Firmicutes (14,67 %), Actinobacteria (5,65 %) und Bacteroidetes (2,57 %) (Abb. 3A, B, Zusatzinformationen 2). Diese vier Phyla machten in den meisten Proben 96–99 % der gesamten OTU aus (Ergänzende Informationen 2). Spirochäten (31,1 %) wurden jedoch in hyperendemischen 8M mit einem hohen Anteil gefunden (Ergänzende Informationen 2). Firmicutes wurden im hyperendemischen Gebiet 1M, 1S, im hyperendemischen Gebiet 3M, 3S und im hyperendemischen Gebiet 7S (Abb. 3A, Zusatzinformationen 2) mit einem höheren Anteil als in anderen Regionen gefunden. Es wurde beobachtet, dass Bacteroidetes in hyperendemischen 1S-, 2S- und 4S-Regionen häufiger vorkommen als in anderen Regionen (Abb. 3A, Zusatzinformationen 2).

Daten auf Gattungsebene wurden analysiert, um bakterielle operative taxonomische Einheiten (OTUs) zu identifizieren, die in allen Mückenproben vorhanden sind. (Abb. 3C, D, Zusatzinformationen 3). Insgesamt wurden 51 Gattungen gefunden, die fünf häufigsten Bakteriengattungen (durchschnittliche Häufigkeit) waren Pseudomonas (29,22 %), Staphylococcus (10,5 %), Erwinia (9,37 %), Serratia (6,91 %) und Acinetobacter (6,7 %) (Abb . 3C,D, Ergänzende Informationen 3). Unterschiede in den Mikrobiomprofilen wurden in verschiedenen Regionen innerhalb des hyperendemischen Gebiets beobachtet. Das der Nordgrenze am nächsten gelegene hyperendemische Gebiet 1 wies einen höheren Staphylococcus-Anteil auf als die anderen Regionen (Abb. 1, 3, Zusatzinformationen 3). Brevibacterium wurde in großer Häufigkeit im hyperendemischen Gebiet 1S gefunden, dieses Mikrobiom wurde jedoch in keiner anderen Region außer im hyperendemischen Gebiet 6S gefunden. Staphylococcus wurde auch häufiger als in anderen Regionen im hyperendemischen Gebiet 3 gefunden, das dem hyperendemischen Gebiet 1 am nächsten liegt. Im hyperendemischen Gebiet 3 dominieren Erwinia und Enterobacteriaceae_uc das Mikrobiomprofil. Erwinia wurde auch in einem hohen Anteil in den hyperendemischen Gebieten 4M und 7M beobachtet. Obwohl es sich um nahegelegene Regionen handelte, zeigten die hyperendemischen Gebiete 4 und 5 unterschiedliche Mikrobiomprofile und es gab auch erhebliche Unterschiede zwischen den Organen. Acinetobacter dominierte das Mikrobiom im hyperendemischen Gebiet 4S, gefolgt von Chryseobacterium, Erwinia und Pseudomonas. Das Mikrobiomprofil des hyperendemischen Gebiets 5M wurde von Enterobacteriaceae_uc dominiert, gefolgt von Serratia. Acinetobacter dominierte das Mikrobiomprofil im hyperendemischen Gebiet 5S, gefolgt von Arcobacter und Pantoea. Im hyperendemischen Gebiet 6 wiesen der Mitteldarm und die Speicheldrüsen ein Mikrobiomprofil auf, das von Serratia und Gibbsiella dominiert wurde. Das Mikrobiomprofil des hyperendemischen Gebiets 7 variierte je nach Organ. Pantoea und Erwinia dominierten im Hyperendemiegebiet 7M, wohingegen Staphylococcus und Asaia im Hyperendemiegebiet 7S dominierten. Das hyperendemische Gebiet 8S zeigte ein ausgeprägtes Mikrobiomprofil, das von Arcobacter dominiert wurde. Die hyperendemischen Gebiete 8M und 2M hatten ein ähnliches Mikrobiom wie die hypoendemischen Gebiete. Pseudomonas dominierte das Mikrobiomprofil aller hypoendemischen Gebiete (Ergänzende Informationen 3).

Mikrobiomprofile erwachsener Anopheles sinensis-Mücken auf Stamm- und Gattungsebene. Die Diagramme auf der linken Seite stellen die Mikrobiomprofile erwachsener weiblicher Anopheles sinensis-Mücken dar, die aus 12 Regionen gesammelt wurden, die in hyperendemische (A: Stammebene, C: Gattungsebene) und hypoendemische (B: Stammebene, D: Gattungsebene) Gebiete unterteilt sind. Jeder Balken stellt das Mikrobiomprofil der gepoolten Probe nach Organ und Region dar (M: Mitteldarm, S: Speicheldrüsen). Die Diagramme in der rechten Seitenleiste stellen den Durchschnitt aller Regionen dar.

Auf Artenebene dominierte Pseudomonas synxantha (24,54 %), gefolgt von Serratia ficaria (6,52 %), Acinetobacter soli (6,12 %), Arcobacter butzleri (4,89 %), Staphylococcus aureus (4,46 %), Pantoea agglomerans (3,7 %) und Erwinia persicina (3,4 %) (Ergänzende Informationen 4). Im hyperendemischen Gebiet variierte ein unterschiedliches Mikrobiomprofil je nach Region im hyperendemischen Gebiet, ähnlich der Gattungsebene (Ergänzende Informationen 4). Die Untersuchung konzentrierte sich auf die Identifizierung von Artenbiomarkern, bei denen es sich um Arten handelt, die ausschließlich in bestimmten Regionen auf Artenebene vorkommen (Tabelle 1). Die hyperendemischen Gebiete 1, 3, 4, 6, 7 und 8 zeigten signifikante Werte. Das regionalspezifische Mikrobiom dominierte im Mikrobiomprofil jeder Region, wie z. B. Serratia ficaria, Staphylococcus sciuri, Erwinia persicina, Staphylococcus aureus, Arcobacter butzleri und Erwinia iniecta.

Zunächst wurden die Durchschnittswerte der Mikrobiome des Mitteldarms und der Speicheldrüsen in allen Regionen verglichen (Ergänzende Informationen 3). Das Mikrobiomprofil der Speicheldrüse bestand aus Pseudomonas (29,32 %), Acinetobacter (12,33 %), Staphylococcus (12,1 %), Arcobacter (9,55 %) und Serratia (5,21 %). Das Mitteldarm-Mikrobiomprofil bestand aus Pseudomonas (29,11 %), Erwinia (14,81 %), Staphylococcus (8,89 %), Serratia (8,61 %) und Pantoea (6,03 %) (Ergänzende Informationen 3). Mikrobiomprofile des Mitteldarms und der Speicheldrüsen wurden anhand ihrer Anwesenheit oder Abwesenheit in den Proben bewertet (Abb. 4).

(A) Venn-Diagramm-Analyse gemeinsamer Gattungen nach Organ (B) Mikrobiomprofil der Speicheldrüsen im Mitteldarm (C). Es gibt 21 Mikrobiota, die sich der Mitteldarm und die Speicheldrüsen teilen, sowie 20 bzw. 10 organspezifische Mikrobiota. Das von beiden Organen geteilte Mikrobiom hatte einen hohen Anteil, und Arcobacter war mit einem Anteil von über 5 % das einzige organspezifische Mikrobiom in den Speicheldrüsen. Bei Acinetobacter gab es einen statistisch signifikanten Unterschied (Wilcoxon-Rangsummentest, \(\textit{p}<0,05\)).

Es wurde festgestellt, dass in beiden Organen die 21 häufig vorkommenden Gattungen weit verbreitet sind, wobei das Mitteldarm-Mikrobiom mehr organspezifische Taxa (20 Gattungen) aufweist als die Speicheldrüsen (10 Gattungen, Abb. 4A). Obwohl organspezifische Mikrobiota wie Arcobacter, Brevibacterium, Chryseobacterium, Asaia und Enterobacteriaceae identifiziert wurden, weist nur Acinetobacter einen statistisch signifikanten Unterschied auf (Abb. 4B, C). Anschließend wurden die Unterschiede nach Organ verglichen, indem die hyperendemischen und hypoendemischen Gebiete unterteilt wurden. Das vorherrschende Mikrobiom im Mitteldarm und in der Speicheldrüse war im hyperendemischen 6-Gebiet (Serratia) und in allen hypoendemischen Gebieten (Pseudomonas) gleich (Tabelle 2). Allerdings war das Mikrobiom, das den Mitteldarm und die Speicheldrüsen dominierte, in hyperendemischen Gebieten unterschiedlich (2–7) (Tabelle 2). Beispielsweise waren Staphylococcus und Brevibacterium im hyperendemischen Gebiet 1, Pseudomonas und Acinetobacter im hyperendemischen Gebiet 2 im Mitteldarm bzw. in den Speicheldrüsen dominant (Tabelle 2).

Die Daten wurden außerdem anhand der Patienteninzidenz verglichen, was eine Unterteilung in hyperendemie- und hypoendemischgebiete ermöglichte. Es gab einen signifikanten Unterschied in den Alpha- und Beta-Diversitätsanalysen basierend auf der Epidemiologie (Tabelle 3, Abb. 2, 6). Die hyperendemischen und hypoendemischen Gebiete waren in der PERMANOVA-Analyse unter Verwendung der Jaccard-Distanz signifikant, die die Unähnlichkeit zwischen Datensätzen bewertet (Tabelle 3). Darüber hinaus war in beiden Gebieten der Shannon-Diversitätsindex, der ein Maß für die Anzahl (Häufigkeit) und relative Häufigkeit (Gleichmäßigkeit) der Arten im Ökosystem ist, signifikant (Abb. 2).

(A) Venn-Diagramm-Analyse gemeinsamer Gattungen nach Epidemiologie. (B) Mikrobiom-Durchschnittsprofil von hyperendemischen und (C) hypoendemischen Gebieten. Mücken in hypoendemischen und hyperendemischen Gebieten teilen sich 11 Mikrobiota, wobei in jedem 23 bzw. 17 einzigartige Mikrobiota identifiziert wurden. In beiden Gebieten wird Pseudomonas beobachtet, das im hypoendemischen Gebiet weitaus häufiger vorkommt. Staphylococcus hatte die höchste Prävalenz im hyperendemischen Gebiet, gefolgt von Erwinia, Pseudomonas, Serratia, Acinetobacter, Arcobacter und Pantoea. Pseudomonas und Pantoea waren die statistisch signifikanten Mikrobiota.

Beide Gebiete teilten 11 Mikrobiota, hauptsächlich Pseudomonas und Acinetobacter. Laut der durchgeführten Analyse wiesen Mücken aus hyperendemischen Gebieten 17 einzigartige Taxa auf, die von Staphylococcus (15,56 %), Erwinia (14,05 %), Pseudomonas (10,46 %), Serratia (10,25 %) und Acinetobacter (9,48 %) dominiert wurden (Abb . 5). In hypoendemischen Gebieten dominiert Pseudomonas (66,73 %) das Mikrobiomprofil, gefolgt von Anaerobacillus (4,49 %) (Abb. 5B). Das Mikrobiomprofil von hyperendemischen und hypoendemischen Gebieten weist bei Pseudomonas und Pantoea erhebliche Unterschiede auf (Abb. 5B, C). Pantoea wurde nur in hyperendemischen Gebieten beobachtet (Abb. 5B, C). Pseudomonas wurde in einem geringen Anteil im hyperendemischen Gebiet gefunden, dominierte jedoch im hypoendemischen Gebiet (Abb. 5B, C).

Die Analyse der prinzipiellen koordinierten Analyse (PCoA) zeigte große Unterschiede in den mikrobiellen Gemeinschaften je nach Epidemiologie und Sammelstelle (Abb. 6). In der Grafik zeigten das Hyperendemiegebiet und das Hypoendemiegebiet unterschiedliche Muster, mit Ausnahme des hyperendemischen Gebiets 2-M, das nahe an der Stichprobe des hypoendemischen Gebiets im Diagramm liegt. Proben im hypoendemischen Gebiet waren unabhängig von der Region geclustert, Proben im hyperendemischen Gebiet wiesen jedoch ein Clustermuster je nach Region auf. Im hyperendemischen Gebiet wurden 3 Häufungen bestätigt (Gruppe 1: 1M, 1S, 3M, 3S, 7M, 7S, 8M, 8S, Gruppe 2: 5M, 6M, 6S, Gruppe 3: 2S, 4M, 4S, 5S) ( Abb. 6). Gruppe 1 teilte Erwinia, Pseudomonas und Staphylococcus, und Gruppe 2 teilte Methylobacterium, Serratia und Gibbsiella. Gruppe 3 teilte Pseudomonas, Acinetobacter, Pantoea und Chryseobacterium (Ergänzende Informationen 3).

3D-Principal Coordinated Analysis (PCoA)-Diagramme der Bray-Curtis-Abstände der Mikrobiomdiversität erwachsener Weibchen von Anopheles sinensis nach Epidemiologie und Organ. Diese Abbildung zeigt Bilder, die in verschiedenen Winkelbereichen aufgenommen wurden. Das PCoA-Diagramm ist ein Diagramm, in dem der Abstand zwischen Gebieten auf der Grundlage ihrer Unähnlichkeit in Bezug auf die relative Häufigkeit (Bray-Curtis) geschätzt wird. Es ist zu erkennen, dass Proben aus dem hyperendemischen Gebiet über eine größere Distanz verteilt sind als diejenigen aus dem hypoendemischen Gebiet, während Proben aus dem hypoendemischen Gebiet näher beieinander liegen.

Die Definition des Mikrobioms an sich hat sich kürzlich von Mikroorganismen, die mit einem Wirt interagieren, auf die Gesamtheit der Mikrobiota und ihrer Genprodukte im Zusammenhang mit der Umwelt und dem Wirt7 ausgeweitet, die Biologie, Langlebigkeit, Verhalten, Ernährung und Immunität beeinflussen25,26,27. Die Mikrobiota des Wirts hat das Potenzial, sich gemeinsam zu entwickeln und die Gesundheit des Wirts kontinuierlich zu beeinflussen8. Es gibt verschiedene Umgebungen, in denen die Mikrobiota erworben werden kann, unter anderem durch Nahrungsaufnahme und Wundinvasion. Dadurch kann der Lebensraum des Wirts das Mikrobiom der Mücke beeinflussen und sich aufgrund regionaler Umweltfaktoren ändern27. Ziel dieser Studie war es zu untersuchen, ob es signifikante Unterschiede in den Mikrobiomprofilen von Mücken zwischen hyperendemischen und hypoendemischen Malariagebieten gibt. Das Hauptziel dieser Studie bestand darin, Mikrobenarten-Biomarker in verschiedenen Endemiegebieten zu identifizieren, die an der Malariainzidenz beteiligt sind. Die aktuelle Studie zeigt, dass das Mikrobiomprofil von Mücken, die in Malaria-Hyperendemie- und Hypoendemiegebieten gesammelt wurden, auf der Ebene von Gattung und Art in unterschiedliche Muster unterteilt war. Mücken in hyperendemischen Gebieten enthielten gebietsspezifische Mikrobiome wie Serratia, Staphylococcus, Erwinia, Enterobacter und Arcobacter, während Pseudomonas in hypoendemischen Gebieten vorherrschend ist, was bedeutet, dass die Malariainzidenz mit gebietsspezifischen Biomarkern analysiert werden kann. Bemerkenswerterweise zeigten unsere Ergebnisse, dass die Heterogenität der Mikrobiomprofile im hyperendemischen Gebiet höher war als im hypoendemischen Gebiet, obwohl der räumliche Abstand zwischen hyperendemischen Gebieten geringer war als im hypoendemischen Gebiet. Es wird vermutet, dass die Malaria-Inzidenz in Südkorea mit den nördlichen Grenzgebieten von Malaria-Hot-Zonen wie Nordkorea zusammenhängt, wo im Jahr 2016 Malariafälle bei über 5.000 Patienten gemeldet wurden28. Als Folge menschlicher Migration, grenzüberschreitender Bevölkerungsübertragungen und ökologischer Veränderungen Aufgrund der Dynamik der Vektorpopulation kommt es in einigen Übertragungsgebieten häufig zu Grenzmalaria29. Malariaausbrüche an den Grenzen zwischen Thailand und Myanmar sowie zwischen Thailand und Kambodscha sind typische Grenzausbrüche und werden durch ständige Bevölkerungsmigration, die Bewegung von Malariapatienten, den Missbrauch von Selbstmedikation und Einschränkungen bei der Verwaltung und Überwachung von Anopheles-Vektoren verursacht29. In Afrika sind die Muster der Malariainzidenz vor allem in den Wüstengebieten südlich der Sahara durch menschliche Migration und geografische Veränderungen wie den Bau von Staudämmen weit verbreitet, während die Malariaübertragung in Südkorea speziell auf nördliche Grenzgebiete beschränkt ist30. Dies deutet darauf hin, dass infizierte Mücken, die aus Nordkorea einwandern, einer der Hauptfaktoren für die Malariainzidenz in Südkorea sein könnten, wenn man die Einschränkung der menschlichen Migration in den nördlichen Grenzgebieten von Südkorea berücksichtigt. Daher ist es wichtig, die Originalität von Malariamücken und ihrem Mikrobiom in hyperendemischen Gebieten zu verfolgen, indem Studien wie Luftnetzmethoden eingesetzt werden, um wandernde Mücken in großen Höhen aus dem Norden der DMZ zu sammeln, was zur Ausrottung der Malaria in ROK31 beitragen könnte.

Das Mikrobiom der hyperendemischen und hypoendemischen Regionen weist große Unterschiede auf (Abb. 6). Dennoch stößt diese Studie auf gewisse Einschränkungen, wenn es darum geht, die regionale Variation des Mückenmikrobioms im hyperendemischen Gebiet umfassend zu verstehen. Obwohl die hyperendemisch 2-M-Probe aus einem hyperendemischen Gebiet entnommen wurde, wies sie ein Mikrobiom auf, das dem ähnelte, das in Proben gefunden wurde, die aus einem hypoendemischen Gebiet entnommen wurden. Darüber hinaus zeigten Proben aus dem hyperendemischen Gebiet drei Häufungen, obwohl dies offenbar keinen starken Zusammenhang mit der Entfernung zwischen den einzelnen Regionen zu haben schien. Weitere Einzelheiten zur Umgebung der Region, in der die Mücke gesammelt wurde (z. B. der Wasserlebensraum der Mücke, Blutquellen usw.) sowie dazu, ob die Mücke mit Plasmodium infiziert ist, sind erforderlich, um die regionalen Unterschiede zu verstehen.

Interessanterweise zeigt unsere Studie, dass Pseudomonas sich deutlich zwischen den Mikrobiomprofilen von Mücken in hyperendemischen und hypoendemischen Gebieten unterscheidet, was zeigt, dass Pseudomonas in hypoendemischen Gebieten vorherrschend war. Pseudomonas kommt häufig in der Darmmikrobiota von Anopheles-Mücken vor32,33,34,35, was darauf hindeutet, dass Pseudomonas in der Lage ist, sich effizient an die Umgebung im Mitteldarm von Anopheles-Mücken anzupassen. Darüber hinaus hat eine frühere Studie ergeben, dass Pseudomonas die am weitesten verbreitete Mikrobiota in den Plasmodium-negativen Gruppen ist36 und Mücken vor der Invasion von Malariaparasiten schützt37. Interessanterweise zeigt unsere Studie einen geringen Anteil der Mikrobiomprofile der Psuedomonas-Population in den hyperendemischen Gebieten, was darauf hindeutet, dass es einige Faktoren wie Malariaparasiten geben könnte, die das Gleichgewicht der Mikrobiota stören. Es wurde berichtet, dass Pseudomonas synxantha das Wachstum von Mycobacterium tuberculosis38 hemmt, das Tuberkulose verursacht, während über die Rolle von Pseudomonas synxantha bei der Mücke wenig bekannt ist. Dennoch wird es interessant sein, die Funktion von Pseudomonas aufzuklären, dem in unserer Studie dominierenden Mikrobiom in hypoendemischen Gebieten. Ein weiterer Schwerpunkt unserer Studie war die Identifizierung von Artenbiomarkern, die für verschiedene Endemiegebiete mit Malariainzidenz in ROK spezifisch sind. Daher dürften weitere Studien zu räumlich-zeitlichen Mustern des Mückenmikrobioms wichtig sein, um eine saisonale Variation des Mikrobioms im Zusammenhang mit der Malariainzidenz zu bestimmen und die Mückenmigration von anderswo nachzuverfolgen.

Obwohl die Hauptfunktion des Mitteldarms und der Speicheldrüsen von Mücken darin besteht, verschiedene Nährstoffe zu verdauen, sind diese Organe für das Wachstum der darmassoziierten Mikrobiota39,40 und die Übertragung von Krankheitserregern durch Mücken41,42,43,44 von entscheidender Bedeutung. Die Übertragung von Malariaparasiten hängt von der Aufrechterhaltung des Parasitenwachstums im Mitteldarm und dem Erreichen virulenter Sporozoitenstadien in den Speicheldrüsen ab45. Daher spielt das regionalspezifische Mikrobiom wie Staphylococcus, Erwinia, Enterobacteriaceae, Serratia, Pantoea und Acinetobacter, das in jedem Teil des hyperendemischen Gebiets dieser Studie identifiziert wurde, eine potenzielle Rolle bei der Interaktion mit Malariaparasiten. Es ist bekannt, dass Serratia marcescens die sporogonische Entwicklung von P. vivax-Parasiten in An blockiert. albimanus46 und Acinetobacter-Arten erhöhen die Resistenz von An. gambiae zur Entwicklung von Plasmodium, teilweise durch die Induktion von Anti-Plasmodium-Faktoren im Imd-Signalweg47. Daher muss die mögliche Rolle dieser regionalspezifischen Mikrobiota in den hyperendemischen Gebieten auf die Auswirkung der Malariaübertragung noch untersucht werden. Zusätzlich zu den Auswirkungen der Mikrobiota auf die Parasitenentwicklung ist bekannt, dass die Mikrobiota das Wirtsverhalten moduliert und so die Vektorkompetenz erhöht. Es wurde berichtet, dass die Kommunikation zwischen Mikrobiom, Darm, Gehirn und Achse die sensorische Wahrnehmungsfähigkeit und das Blutsaugverhalten von Mücken durch spezifische Neuropeptide verändern kann, die von bestimmten Mikrobiota abgesondert werden48. Mit Malariaparasiten infizierte Mücken zeigen ein stärkeres Blutsaugverhalten, was die Anzahl der Bisse und das präzise Auffinden menschlicher Wirte erhöht49, was darauf hindeutet, dass es in der modifizierten Mikrobiota-Gemeinschaft zu einigen Veränderungen in der Mikrobiom-Darm-Hirn-Achsen-Kommunikation kommen könnte. Interessanterweise wurde gezeigt, dass die schnelle Vermehrung von Pseudomonas im Mitteldarm der Mücke nach der Bluternährung die Sekretion von Serotonin induziert, um den Appetit zu unterdrücken, gefolgt von der Sekretion von Neuropeptid Y (NPY) im Gehirn der Mücke48,50,51, Es spielt eine entscheidende Rolle bei der Modulation sensorischer Sensibilitäten wie dem Geruchssinn51. Frühere Daten deuten darauf hin, dass eines der Neuropeptide, Tachykinin, auch Geruchswege und Insulinwege bei Insekten moduliert52 und synaptische Kontakte zwischen Terminals von tachykinergen Neuronen und NPY-Neuronen die NPY-Neuronenaktivität bei Ratten regulieren53, was darauf hindeutet, dass aus dem Mikrobiom sezernierte Neuropeptide das Wirtsfindungsverhalten von verändern können die Mücke über diese neuronalen Bahnen. Zusammenfassend liefert unsere Studie Hinweise darauf, dass die Mikrobiomzusammensetzung im Mitteldarm und in den Speicheldrüsen räumlich dynamische Muster aufweist und möglicherweise die Malariainzidenz bei ROK beeinflusst. Zusätzliche räumlich-zeitliche Variationen des Mikrobioms werden genauere Hinweise zum Verständnis der Herkunft von Malariamücken in hyperendemischen Gebieten liefern. Es wird auch interessant sein, die molekularen und neuronalen Mechanismen der Mikrobiom-Darm-Hirn-Achsen-Kommunikation zwischen Wirt, Mikrobiom und Parasit aufzuklären, die der Modulation des Wirtsfindungsverhaltens zugrunde liegen. Obwohl diese Studie eine Momentaufnahme der Mikrobiommuster in Malaria-Endemiegebieten in ROK liefert, werden zukünftige Studien erforderlich sein, um die Plasmodium-Konzentration in den Mückenproben abzuschätzen, um die genauen Muster und Dynamiken des Mikrobioms in einer einzelnen Mücke vollständig zu verstehen, was eine Erklärung liefern könnte die Korrelation zwischen Plasmodium-Sporen und der Mikrobiomzusammensetzung. Später wird ein umfassendes Verständnis der Mikrobiommuster von Malariamücken in der Republik Korea und auf der koreanischen Halbinsel die Bemühungen des Malaria-Ausrottungsprogramms abschwächen.

Weibliche erwachsene Anopheles-sinensis-Mücken wurden im Jahr 2020 (22. bis 26. Juni) in 12 ländlichen Regionen in Südkorea mit Unterstützung des regionalen Zentrums für Vektorüberwachung gegen den Klimawandel gesammelt, das von den Korea Centers for Disease Control and Prevention54 unterstützt wird. Die Sammelstellen wurden als Hyperendemiegebiet eingestuft, wenn die Anzahl der Malariafälle pro 100.000 Personen 1 Patienten übersteigt. Ansonsten wurde es als Hypoendemiegebiet kategorisiert (Abb. 1). Die Untersuchungsregionen wurden anhand von Statistiken über Malariapatienten bestimmt. Die Analyse könnte den Lebensraum oder die Ökologie falsch berücksichtigt haben, da nicht jede Region ökologisch analysiert wurde. Die Mücken wurden anhand der morphologischen Schlüssel55 in Gattungen eingeteilt, und die Artenidentifikation wurde mithilfe eines diagnostischen PCR-Assays auf der Grundlage einer DNA-Barcode-Analyse56 bestätigt. Mückenkörperteile wie Beine und Flügel wurden in ein 1,5-ml-Röhrchen (Axygen, USA) überführt. Anschließend erfolgte die DNA-Extraktion aus Mückenteilen mit dem G-spin™ Total DNA Extraction Kit (iNtRON's, Korea) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die Parameter des PCR-Zyklus umfassten eine anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 3 Minuten, 35 Zyklen von 30 Sekunden bei 95 °C, 30 Sekunden bei 63 °C und 2 Minuten bei 72 °C. Eine letzte Verlängerung bei 72 °C für 10 Minuten wurde abgeschlossen. PCR-Produkte wurden einer Elektrophorese auf einem 1,5 %igen Agarosegel unterzogen und unter ultraviolettem Licht sichtbar gemacht.

Die DNA-Extraktion zielte auf den Mitteldarm und die Speicheldrüse erwachsener weiblicher Mücken ab. Vor der Sektion wurden die Mücken 1 Minute lang in 70 % Ethanol oberflächensterilisiert und dann in PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) präpariert. Der Arbeitsbereich des präparierenden Stereomikroskops wurde während der Dissektion ebenfalls mit 70 % Ethanol desinfiziert. Mitteldärme und Speicheldrüsen wurden gepoolt (jede Probe bestand aus 5 Mücken) und bei –80 °C aufbewahrt. Die gesamte Genom-DNA wurde unter aseptischen Bedingungen mit dem Power Soil Kit (Qiagen, Deutschland) gemäß den Empfehlungen des Herstellers extrahiert. Die Proben wurden für die 16S-Metagenomanalyse verwendet, nachdem die DNA-Qualität und -Quantität überprüft wurden. Es wurden zwei 16S-rRNA-markierte Bibliotheken basierend auf Amplifikaten erstellt.

Für alle Proben führte das National Instrumentation Center for Environmental Management (NICEM, Korea) eine PCR-Amplifikation, Probenverarbeitung und 16S-rRNA-Gensequenzierung durch (www.nicem.snu.ac.kr). Die Proben wurden mit dem 2 × KAPA HiFi HotStart ReadyMix (Roche, Schweiz) und Primern für die V3–V4-Region des 16S-rRNA-Gens amplifiziert (Supplementary Information 5). Die folgenden PCR-Bedingungen waren: 3 Minuten bei 96 °C, dann 30 Zyklen von 30 Sekunden bei 96 °C, 30 Sekunden bei 55 °C, 30 Sekunden bei 72 °C und schließlich 5 Minuten bei 72 °C. Alle PCR-Ergebnisse wurden dann auf 1,2 % Agarosegelen durchgeführt, um Bandengröße und -intensität zu bestimmen. Ampure XP-Perlen (Beckman, USA) wurden verwendet, um amplifizierte DNA aus jeder Probe zu reinigen. Je nach DNA-Gehalt und Molekulargewicht wurden die Proben in identischen Mengen gepoolt und zur Erstellung von Illumina-DNA-Bibliotheken verwendet. Die Bibliotheken wurden dann in Illumina MiSeq-Läufen sequenziert, um 2 × 300 bp Paired-End-Reads zu erhalten. Die Paired-End-Sequenzierungs-Reads wurden zunächst in die QIIME2 v.2021.1157-Pipelines importiert, um „quantitative Einblicke in die mikrobielle Ökologie“ zu erhalten, und die Version 2021.11 der Pipeline wurde zur Verarbeitung und Analyse der Sequenzierungs-Reads verwendet. Der Befehl „denoise-paired“ wurde verwendet, um Fehler zu korrigieren, Chimären zu eliminieren und Paired-End-Lesevorgänge mithilfe des DADA2-Plugins in QIIME 258 zu integrieren. Die generierte Sequenz wurde später zum Vergleich der Bakterienzusammensetzung und der Taxonomieanalyse verwendet. Darüber hinaus wurde die Chunlab-Analysepipeline PKSSU 4.0 DB verwendet, um Sequenzen auf einem Divergenzniveau von 3 % (oder 97 % Ähnlichkeit) zu gruppieren, Sequenzen wurden entrauscht und einer operativen taxonomischen Einheit (OTU) zugeordnet. Chimäre Sequenzen, die nicht definitiv einer OTU zugeordnet werden konnten, wurden eliminiert. OTUs, die nicht taxonomisch kategorisiert werden konnten, wurden als „nicht klassifiziert“ gekennzeichnet und von der weiteren Analyse ausgeschlossen. Für unsere Analyse wurden Datensätze auf Stamm-, Gattungs- und Artenebene verwendet. Auf jeder Ebene werden Zähl- und Verhältnisdaten gleichermaßen bereitgestellt und Verhältnisdaten wurden für die Analyse verwendet. Zum Vergleich wurden die Verhältnisdaten in Epidemiologie und Organ unterteilt (Ergänzende Informationen 2–4).

Auf Stamm-, Gattungs- und Artenebene wurden Lesezahl- und Häufigkeitsdaten für bakterielle OTUs ausgewertet. Taxa mit geringer Häufigkeit und einem Wert von weniger als 1 % wurden in die Kategorie „Andere Bakterien“ eingeteilt. Die EzBioCloud 16S-Datenbank ist so konzipiert, dass sie am besten für die Identifizierung auf Artenebene geeignet ist, auch wenn es aufgrund fehlender Sequenzunterschiede bei einigen eng verwandten Arten Einschränkungen gibt. Die Kombination von EzBioCloud 16S DB und sensiblen Bioinformatik-Pipelines ermöglicht uns die Erforschung von Mikrobiomdaten auf Artenebene.

Speziesbiomarker wurden verwendet, um Mikrobiota zu finden, die für jede Sammelstelle spezifisch sind. Alle Analysen wurden mit „16S-based Microbiome Taxonomische Profile (MTP) – Vergleichender Analysator für MTP-Sets – Taxonomische Biomarker-Erkennung“ unter Verwendung der EzBioCloud-Anwendung durchgeführt. Eine Gruppe mit Proben aus allen Regionen und eine Gruppe mit nur Proben aus einer bestimmten Region wurden mit dem Kruskal-Wallis-H-Test verglichen und unter den Mikrobiota mit statistisch signifikanten Werten wurden die zwei oder drei Mikrobiota mit dem höchsten Verhältnis als Artenbiomarker ausgewählt (Ergänzende Informationen 6).

Die Shannon-Diversität, Jaccard und der Bray-Curtis-Dissimilaritätsindex wurden verwendet, um die mikrobielle Diversität innerhalb (Alpha-Diversität) und zwischen (Beta-Diversität) Proben in QIIME2 zu analysieren. Die resultierenden durchschnittlichen Shannon-Indizes wurden angegeben und zwischen den Proben verglichen, wobei paarweise Kruskal-Wallis-Tests mit Benjamini-Hochberg-FDR-Korrekturen für mehrere Vergleiche verwendet wurden. Die Ergebnisse der Jaccard- und Bray-Curtis-Unähnlichkeitsindizes wurden zwischen Stichproben unter Verwendung gepaarter PERMANOVA-Tests (999 Permutationen) mit FDR-Korrekturen verglichen. Die oben beschriebenen statistischen Analysen wurden mit EZbiocloud59 (https://www.ezbiocloud.net/) und QIIME260 durchgeführt.

Die aus dieser Studie erhaltenen Metagenomdaten wurden im NCBI unter dem BioProject PRJNA844511 hinterlegt. Alle relevanten Daten sind entweder im Papier enthalten oder werden eingereicht und sind in einem öffentlichen Repository bei NCBI verfügbar.

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Diese Arbeit wurde durch einen Forschungsfonds der Korea Disease Control and Prevention Agency (KDCA; 6332-304-210 und 6331-311-210) unterstützt. Diese Arbeit wurde durch das Research Assistance Program (2021) der Incheon National University unterstützt. Wir freuen uns, dass 16 regionale Zentren für Vektorüberwachung gegen den Klimawandel landesweit Proben sammeln, darunter Soon-Won Lee (GangwonDo Institute of Health & Environment), Bo-Young Jeon (Yonsei University), Tong Soo Kim (Inha University), Hyung- Wook Kwon (Nationaluniversität Incheon), Doo-Hyung Lee (Universität Gachon), Gil-Hah Kim (Nationaluniversität Chungbuk), Sung Hoon Jung (Nationaluniversität Chungnam), Yong Seok Lee (Universität Soonchunghyang), Chul Park (Universität Gwangju für Gesundheit). ), Yeon Soo Han (Chonnam National University), Hyun Cheol Lim (JeollanamDo Institute of Health & Environment), Ohseok Kwon (Kyungpook National University), Young Ho Kim (Kyungpook National University), Dong-Kyu Lee (Kosin University), Kwang Shik Choi (Kyungpook National University) und Young Min Yun (Jeju National University).

Abteilung für Biowissenschaften, Incheon National University, 119 Academy-ro, Yeonsu-gu, Incheon, 22012, Republik Korea

Jeong Hyeon Lee, Bilal Mustafa und Hyung Wook Kwon

Konvergenzforschungszentrum für Insektenvektoren, 119 Academy-ro, Yeonsu-gu, Incheon, 22012, Republik Korea

Jeong Hyeon Lee, Bilal Mustafa und Hyung Wook Kwon

Abteilung für Vektoren und parasitäre Krankheiten, Korea Disease Control and Prevention Agency, 187 Osongsaenmyeong2-ro, Osong-eup, Heungdeok-gu, Chunbuk, Cheongju, 28159, Republik Korea

Hyun-Woo Kim & Hee Il Lee

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JHL, HIL und HWKwon haben das Experiment entworfen. JHL und BM führten Experimente, Analysen und Kunstwerke durch. HWKim führte Probenentnahmen und DNA-Extraktionsexperimente durch. JHL, HWKim, BM, HIL und HWKwon haben den Hauptmanuskripttext geschrieben. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Hee Il Lee oder Hyung Wook Kwon.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Lee, JH, Kim, HW., Mustafa, B. et al. Die Beziehungen zwischen Mikrobiomvielfalt und Epidemiologie bei einheimischen Arten von Malaria-vermittelten Mücken in Korea. Sci Rep 13, 9081 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35641-3

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Eingegangen: 06. Mai 2022

Angenommen: 21. Mai 2023

Veröffentlicht: 05. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35641-3

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