Ebselen-Derivate hemmen SARS

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 9161 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Von SARS-CoV-2 kodierte Proteasen stellen ein vielversprechendes Ziel für neue Therapien gegen COVID-19 dar. Die SARS-CoV-2-Hauptprotease (Mpro, 3CLpro) und die Papain-ähnliche Protease (PLpro) sind für die Spaltung viraler Polyproteine verantwortlich – ein Prozess, der für das Überleben und die Replikation des Virus entscheidend ist. Kürzlich wurde gezeigt, dass 2-Phenylbenzisoselenazol-3(2H)-on (Ebselen), ein entzündungshemmendes niedermolekulares Organoselen-Medikament, ein wirksamer kovalenter Inhibitor beider Proteasen ist und seine Wirksamkeit in enzymatischen und antiviralen Tests bewertet wurde. In dieser Studie haben wir eine Sammlung von 34 Ebselen- und Ebselendiselenid-Derivaten auf SARS-CoV-2 PLpro- und Mpro-Inhibitoren untersucht. Unsere Studien ergaben, dass Ebselen-Derivate wirksame Inhibitoren beider Proteasen sind. Wir haben drei PLpro- und vier Mpro-Inhibitoren identifiziert, die Ebselen überlegen sind. Unabhängig davon wurde gezeigt, dass Ebselen die N7-Methyltransferase-Aktivität des SARS-CoV-2-nsp14-Proteins hemmt, das an der viralen RNA-Cap-Modifikation beteiligt ist. Daher wurden ausgewählte Verbindungen auch als NSP14-Inhibitoren bewertet. Im zweiten Teil unserer Arbeit verwendeten wir 11 Ebselen-Analoga – Bis(2-carbamoylaryl)phenyldiselenide – in biologischen Tests, um ihre Anti-SARS-CoV-2-Aktivität in Vero-E6-Zellen zu bewerten. Wir stellen ihre antivirale und zytoprotektive Aktivität sowie ihre geringe Zytotoxizität vor. Unsere Arbeit zeigt, dass Ebselen, seine Derivate und Diselenid-Analoga eine vielversprechende Plattform für die Entwicklung neuer antiviraler Medikamente gegen das SARS-CoV-2-Virus darstellen.

Im Winter 2019 kam es in Wuhan, China, zu einem Ausbruch einer Lungenentzündung mit grippeähnlichen Symptomen1,2. Kurz darauf wurde der krankheitsverursachende Erreger isoliert und analysiert, was zur Identifizierung des neuartigen, hochansteckenden menschlichen Beta-Coronavirus SARS-CoV-2 (früher bekannt als 2019-nCoV)3 führte. Bis Februar 2023 wurde bei über 674 Millionen Menschen die Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) diagnostiziert, die Zahl der Todesopfer lag weltweit bei über 6,86 Millionen Patienten4. Neu entwickelte COVID-19-Impfstoffe basieren auf der Immunogenität des viralen Spike-Proteins (S). Das Auftauchen neuer SARS-CoV-2 Variants of Concern (VOCs) unterstreicht jedoch den Bedarf an neuen antiviralen Medikamenten, die auf die konservierteren Nichtstrukturproteine (nsps) abzielen. des Virus5,6. Es wurden verschiedene Strategien eingesetzt, um die Suche nach einer wirksamen Therapie zur Bekämpfung des Erregers zu beschleunigen7. Eine dieser Strategien ist die Wiederverwendung von Arzneimitteln – die Etablierung therapeutischer Eigenschaften bereits zugelassener Substanzen für neue medizinische Anwendungen. Diese Strategie kann durch rechnerische Analysen unterstützt werden, die die Kosten senken, den Prozess im Vergleich zur De-novo-Entwicklung neuer Therapeutika beschleunigen und als erste Stufe beim Screening umfangreicher Wirkstoffbibliotheken dienen können8,9,10,11,12. Die Neupositionierung von Medikamenten wurde bereits im Kampf gegen COVID-1913 eingesetzt. Ein Beispiel hierfür ist Remdesivir, ein antiviraler Wirkstoff, der auf die virale RNA-abhängige RNA-Polymerase (RdRp) abzielt und zur Behandlung von Ebola vorgesehen war, sich jedoch bei der Verkürzung der Genesungszeit und der Verringerung der Mortalität als wirksam erwiesen hat und zunächst schwerwiegende Nebenwirkungen bei COVID-19-Patienten verursacht hat Studien14. Nach ausgedehnten klinischen Studien kam das Solidarity Trial Consortium der WHO jedoch zu dem Schluss, dass die Behandlung mit Remdesivir Todesfälle bei hospitalisierten COVID-19-Patienten nicht oder nur einen kleinen Teil davon verhindert. In der Studie bewerteten die Forscher auch die Wirksamkeit anderer wiederverwendeter Medikamente – Hydroxychloroquin, Lopinavir und Interferon Beta-1a. Infolgedessen erbrachten die Medikamente keinen oder nur einen geringen Nutzen für Krankenhauspatienten, ohne dass sich die Krankenhausaufenthaltszeit, die Sterblichkeit und der Beginn der Beatmung verringerten15. Kürzlich wurden zwei oral verabreichte Medikamente auf den Markt gebracht. Pfizers PF-07321332 (Nirmatrelvir) ist ein SARS-CoV-2-Mpro-Inhibitor und wird in Kombination mit Ritonavir unter dem Namen Paxlovid vermarktet (https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04960202; [abgerufen am 21. September 2021). ]). Das zweite Medikament, Molnupiravir, das von Merck und Ridgeback Biotherapeutics entwickelt wurde, ist ein viraler RNA-abhängiger RNA-Polymerase (RdRp)-Inhibitor (https://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04939428; [abgerufen am 21. September 2021]). Dennoch sind die aktuellen Behandlungsmöglichkeiten äußerst begrenzt und die Suche nach neuen Therapeutika für COVID-19-Patienten stellt eine große Herausforderung für die wissenschaftliche Gemeinschaft dar.

Um das Problem anzugehen, identifizierten Wissenschaftler unter viralen Nichtstrukturproteinen medikamentöse Ziele, darunter zwei Proteasen. Die SARS-CoV-2-Hauptprotease (Mpro, 3CLpro, nsp5) und die Papain-ähnliche Protease (PLpro, nsp3 Papain-ähnliche Proteasedomäne) ermöglichen die Virusreplikation in Wirtszellen, indem sie das virale Polyprotein verarbeiten und 16 für das Virus entscheidende NSPs erzeugen Reproduzieren. SARS-CoV-2 Mpro erzeugt 13 virale NSPs und ist damit ein wichtiger Akteur im Prozess der Virusreplikation und -reifung16,17,18. Mpro ist eine Cysteinprotease mit einer Struktur, die bei menschlichen Coronaviren hochkonserviert ist. In Lösung liegt das Enzym sowohl als Monomere als auch als Homodimere vor, aber nur die homodimere Form der Protease besitzt die volle katalytische Aktivität18,19,20,21. Eine ungewöhnliche Präferenz für einen Glutaminrest an der P1-Position der Substratspaltungsstelle unterscheidet Mpro von bekannten menschlichen Proteasen. Diese Funktion kann für die Entwicklung und Synthese wirksamer antiviraler Breitbandwirkstoffe mit minimalen Nebenwirkungen von Vorteil sein9,18,19,21,22,23. SARS-CoV-2 PLpro ist eine virale Cysteinprotease, die aufgrund ihrer pathophysiologischen Rolle als hervorragendes Ziel für die Behandlung von COVID-19 vorgeschlagen wird. PLpro verarbeitet virale Polyproteine, um nsp1–3-Proteine zu erzeugen. Darüber hinaus verändert die Protease auch die Immunantwort des Wirts durch Deubiquitinierung und DeISGylierung von Proteinen in infizierten Zellen24,25,26,27. Somit würde die PLpro-Hemmung nicht nur die Replikation des Virus blockieren, sondern auch die durch ISG15 und Ubiquitin vermittelte Fehlregulation der zellulären Signalübertragung begrenzen.

2-Phenylbenzisoselenazol-3(2H)-on (Ebselen), erstmals 1924 von Lesser und Weiß hergestellt28, ist ein niedermolekulares Arzneimittel mit einer pleiotropen Wirkungsweise in Zellen29. Ebselen ist ein ausgezeichneter ROS-Fänger, der als Nachahmer des Selenoenzyms Glutathionperoxidase (GPx) fungiert und durch Oxidation von reduziertem TrxR30,31,32 mit dem Thioredoxin (Trx)-System interagiert. Während der GPx-ähnlichen Aktivität durchläuft Ebselen eine Reihe von Reaktionen, die in katalytischen Zyklen angeordnet sind. Daten deuten darauf hin, dass die Art der Reaktionen von den zellulären Konzentrationen von Thiolen und Wasserstoffperoxid abhängt30,33,34,35,36,37. Kürzlich wurde gezeigt, dass Ebselen beide SARS-CoV-2-Proteasen hemmt. Weglarz-Tomczak et al. untersuchten Ebselen und eine Sammlung seiner Derivate als Inhibitoren des PLpro, was zur Identifizierung von Inhibitoren mit IC50-Werten im nanomolaren Bereich führte38. Ebselen und seine Derivate wurden auch in einer Studie von Amporndanai et al. eingesetzt, die die hemmende Wirksamkeit dieser Verbindungen gegen SARS-CoV-2 Mpro untersuchten und einen Mechanismus für die katalytische Cys145-Selenierung des Enzyms vorschlugen39. Die getesteten Verbindungen zeigten in rekombinanten Enzymtests submikromolare IC50-Werte und in zellulären Tests eine Anti-SARS-CoV-2-Aktivität mit EC50 im niedrigen mikromolaren Bereich. Darüber hinaus waren Ebselen-Derivate in antiviralen Tests Ebselen überlegen. In einer anderen Studie wurde eine Bibliothek von etwa 10.000 Medikamenten und Medikamentenkandidaten auf Mpro-Inhibitoren untersucht. Dadurch wies Ebselen den niedrigsten IC50-Wert unter den getesteten Substanzen auf (0,67 µM) und zeigte darüber hinaus auch eine antivirale Wirkung in SARS-CoV-2-infizierten Vero-Zellen9. In einer Studie von Cao et al. Die Forscher führten eine HTS der Verbindungsbibliothek der NIH Clinical Collection durch. Ebselen gehörte in Zelltests zu den wirksamsten antikoronaviralen Wirkstoffen40. In einer von Mangiavacchi et al. durchgeführten Studie wurde gezeigt, dass die Einführung eines Selenatoms in die Struktur eines Quercetin-Derivats dessen antivirale Wirkung im Vergleich zu Quercetin um fast das 24-fache steigert, was auf die Bedeutung von Organoselenverbindungen bei der Entdeckung neuer antiviraler Medikamente hinweist41 .

Jüngste Studien haben gezeigt, dass Ebselen auch die RNA-Cap-Guanin-N7-Methyltransferase42- und Exonuklease43-nsp14-Aktivitäten von SARS-CoV-2 hemmt. Nsp14 ist ein bifunktionales Enzym mit einer unabhängig funktionierenden N7-Methyltransferase (N7-MTase)-Domäne und einer Nsp10-abhängigen Exonukleasedomäne44. Das Enzym ist an der 5′-Endverkappung neu synthetisierter viraler mRNAs beteiligt, was für die Stabilität des viralen Transkripts und die Proteinbiosynthese von entscheidender Bedeutung ist. Die Rolle der nsp14-N7-MTase besteht darin, die Reaktion des Methylgruppentransfers von S-Adenosyl-l-methionin (SAM) auf die N7-Position von Guanosin-5′-triphosphat am 5′-RNA-Ende (Gppp-RNA) zu katalysieren. , was zu einer Cap-0-Formation führt43. Es wurde bereits gezeigt, dass die Hemmung viraler N7-MTasen die Virusreplikation unterdrückt45, einschließlich der von SARS-CoV44. Daher gilt das Enzym nsp14 als gutes Ziel für die Entwicklung antiviraler Medikamente (Abb. 1)46.

Vereinfachter Lebenszyklus von SARS-CoV-2. Das Virus dringt in die Zelle eines Wirts ein und setzt sein Genom im Zytoplasma frei. Virale RNA wird in zwei Polyproteine übersetzt: pp1a und pp1ab. Anschließend werden durch Autospaltung zwei virale Proteasen (PLpro und Mpro) freigesetzt. Ihre Hauptaufgabe besteht darin, Polyproteine weiterzuverarbeiten, was zur Freisetzung anderer NSPs führt. Als nächstes bildet eine Gruppe von NSPs Replikations- und Transkriptionskomplexe (RTCs). RTCs sind außerdem an der Erzeugung von Kopien viraler genomischer RNA (g-RNA) sowie einer Reihe subgenomischer RNAs (sg-RNA) beteiligt, die für die Synthese viraler Struktur- und akzessorischer Proteine verantwortlich sind. Virionen werden in endoplasmatischen Retikulum-Golgi-Zwischenkompartimenten (ERGICs) zusammengebaut. g-RNA ist mit strukturellem N-Protein umhüllt und gelangt in das ERGIC, das die Glykoproteine M, E und S enthält. Anschließend werden die Virionen durch Exozytose freigesetzt47,48. Die Hemmung von Mpro, PLpro und N7-MTase kann zur Unterdrückung der Virusreplikation führen. Die Hemmung der Protease stoppt die Bildung von NSPs, während die Hemmung der N7-MTase die Synthese stabiler Transkripte der viralen RNA verhindert. Erstellt mit BioRender.com.

Die Wirksamkeit von Ebselen und anderen Organoselenverbindungen wurde bereits bei Infektionen mit HIV49,50, HSV251, HCV52 und Zika-Virus53 untersucht. Darüber hinaus präsentiert ein aktueller Bericht Ebselen und seine Derivate als wirksame Inhibitoren von SARS-CoV-2 PLpro38. Derzeit wird Ebselen in klinischen Phase-2-Studien als orales Therapeutikum bei mittelschweren und schweren COVID-19-Patienten evaluiert (https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04484025; https://clinicaltrials.gov/ct2/show). /NCT04483973; [abgerufen am 10. August 2021]). In dieser Arbeit untersuchten wir Ebselen-Derivate und -Analoga als potenzielle Anti-SARS-CoV-2-Wirkstoffe. Die geringe Toxizität von Ebselen und die laufenden klinischen Studien machen es als Leitsubstanz attraktiv. Zunächst haben wir eine Sammlung von 23 Ebselen- und 11 Ebselen-Diselenid-Derivaten gescreent und die Werte der halbmaximalen Hemmkonzentration (IC50) für die vielversprechendsten 2-Phenylbenzisoselenazol-3(2H)-one ermittelt, um ihre Eigenschaften als SARS-CoV-2 zu bewerten PLpro- und Mpro-Inhibitoren. Als nächstes untersuchten wir mithilfe eines Py-FLINT-Fluoreszenzassays die hemmenden Eigenschaften der NSP14-N7-MTase für ausgewählte Ebselen-Derivate gegenüber dem rekombinanten Enzym. Ebselens „offene Form“ – Bis[2-(N-phenylcarbamoyl)phenyl]diselenid – wird als eines der Zwischenprodukte während der Ebselen-Katalysezyklen in lebenden Organismen vorgeschlagen (siehe Abb. 2), und in der zellulären Umgebung könnte die Verbindung als Reservoir fungieren entsprechende Benzisoselenazolone, die virale Enzyme hemmen und am Schutz gegen H2O2 und andere ROS54 beteiligt sind. Daher haben wir die Anti-SARS-CoV-2-Aktivität in einem auf RNA-Reduktion basierenden Assay und auf zytopathischer Wirkung basierenden Assays in Vero E6-Zellen für 11 Bis[2-(N-arylcarbamoyl)phenyl]diselenide bestimmt. Schließlich zeigen wir, dass Ebselen eine potenzielle Leitverbindung für die Entwicklung neuartiger antiviraler Wirkstoffe mit minimaler zytotoxischer Wirkung in vivo darstellen könnte. Die Ergebnisse können bei der Entwicklung neuer Wirkstoffe nützlich sein, die auf die von SARS-CoV-2 kodierten Proteasen abzielen und bei der Behandlung von COVID-19 eingesetzt werden sollen.

Plausibler Katalysezyklus von Ebselen mit Wasserstoffperoxidreduktion, einschließlich der Bildung der offenen Form von Ebselen (dunkelblaue Farbe)33,37.

Die Synthese biologisch aktiver Organoselenverbindungen ist Gegenstand vieler Forschungsteams auf der ganzen Welt35,55,56. Ebselen und andere Benzisoselenazol-3(2H)-one wurden bereits auf verschiedene Weise hergestellt57,58. Die Strukturen der in der Sammlung enthaltenen Verbindungen sind in Tabelle 1 dargestellt. Das allgemeine Verfahren zur Herstellung von Ebselen, seinen Derivaten (1–23) und ihren Analoga (24–34) ist in Abb. 3 dargestellt. 2,2′-Dicarboxydiphenyl Diselenid (36) wurde durch aufeinanderfolgende Protonierung, Diazotierung und Dinatrium- oder Dilithiumdiselenid-Selenylierung von Anthranilsäure (35) erhalten. In den nächsten Schritten führten die Reaktionen von Diselenid 36 mit Thionylchlorid in Benzol in Gegenwart von DMF bei Lösungsmittelrückfluss zu 2-(Chlorseleno)benzoylchlorid (37) oder Bis[(2-chlorcarbonyl)phenyl]diselenid (38), je nachdem die eingesetzten Mengen Thionylchlorid. Tandem-Selenylierungs-/Acylierungsreaktion59 von Anilin oder seinen Phenylring-substituierten Derivaten mit 2-(Chlorseleno)benzoylchlorid (37) in wasserfreiem MeCN oder DCM in Gegenwart einer trockenen Et3N-Base ergab Ebselen und seine Derivate 1–23. Die Acylierungsreaktion von Phenylring-substituierten Anilinen mit dem Chlorid 38 in wasserfreiem DCM in Gegenwart von wasserfreiem Na2CO3 als Base ergab die Analoga 25–3460 in der „dimeren“ Form von Ebselen. Insbesondere Carbamoylphenyldiselenid 24 wurde durch Reduktion von Ebselen mit Hydrazinmonohydrat in Methanol als Lösungsmittel hergestellt61. Die Reinheit der Verbindungen betrug > 95 %, wie durch LC-MS-Analyse bestätigt (siehe ergänzende Informationen).

Herstellung von Ebselen, seinen Derivaten und ihren „dimeren“ Formanaloga 1–33. Reagenzien und Bedingungen: (a) (i) wässrig. HCl, (ii) NaNO2, − 7 bis + 7 °C, (b) (i) NaSeSeNa, MeOH, NaOH oder LiSeSeLi, THF, HMPTA, − 7 bis + 5 °C, (ii) aq. HCl, (c) 7 Äquiv. SOCl2, Kat.-Nr. (DMF), Benzol, Rückfluss, (d) RNH2, Et3N, MeCN oder DCM, (e) 3,5 Äquivalente SOCl2, Kat. (DMF), Benzol, Rückfluss, (f) RNH2, Na2CO3, DCM, (g) H2N-NH2∙H2O, MeOH, Rückfluss. (Durchgeführt gemäß Ref. 60,62,63,64.

FT-IR-Spektren wurden im Kristallgitter oder in KBr gemessen und die 1H-, 13C-, 77Se- und 19F-NMR-Spektren wurden im Allgemeinen in DMSO-d6 gemessen. Für Ebselen und seine Analoga 1–23 lagen die Wellenzahlen, die der Streckschwingung von Carbonylgruppen (C=O) entsprechen, bei etwa 1583–1649 cm−1, Stickstoff-Kohlenstoff-Einfachbindungen mit Substituentenbändern (CN) lagen bei 1305–1363 cm− 1 und C-Se bei 727–747 cm−1, darüber hinaus stimmen die Schwingungen der Diselenide 24–34 mit den zuvor berichteten Daten überein60. Im Benzisoselenazol-3(2H)-on-Bereich der in DMSO-d6 gemessenen NMR-Spektren wurden die Protonen-H-4-, H-5-, H-6- und H-7-Resonanzen der Verbindung 1–23 bei 7,85 beobachtet –7,94, 7,45–7,51, 7,52–7,78 bzw. 8,05–8,12 ppm und der Kohlenstoff C=O, C-3′, C-4, C-5, C-6, C-7 und C–Se Resonanzen wurden im Allgemeinen bei 164,87–166,08, 126,43–128,53, 127,73–128,22, 126,06–126,52, 132,07–133,01, 125,71–126,07 bzw. 138,50–140,59 ppm beobachtet, während das Kohlenstoffatom eines Phenyls Substituent verknüpft mit Heteroaromaten (PhC- 1) Resonanzen wurden bei 119,7–146,3 ppm beobachtet, abhängig von den verwendeten Substituenten. Die 77Se-NMR-Resonanz von Benzisoselenazolonen (1–33 beobachtet bei 914,33–974,90 ppm) und Diseleniden (25–34 beobachtet bei 443,48–447,93 ppm) stimmt mit zuvor veröffentlichten Daten überein64,65,66. Für die Benzisoselenazolone 1, 14, 15, 17 und 5 fanden wir Selenfluorid-Spin-Spin-Kopplungskonstanten 4J(77Se–19F) und 5J(77Se–19F) von 15,1–25,5 Hz bzw. 10,7 Hz. Es wurden keine 6–7J(77Se–19F)-Spin-Spin-Konstanten gemessen.

Zunächst bewerteten wir die Hemmeigenschaften von Ebselen und den Verbindungen 1–23 bei einer Inhibitorkonzentration von 1 µM mit 100 nM SARS-CoV-2 PLpro und bei einer Inhibitorkonzentration von 100 nM mit 100 nM SARS-CoV-2 Mpro. Für PLpro verwendeten wir ein fluoreszierendes Ac-LRGG-ACC-Substrat mit einer Struktur, die auf dem C-terminalen Epitop von Ub- und ISG15-Proteinen sowie auf den nsp1/2-, nsp2/3- und nsp3/4-Spaltstellen im basiert Coronavirales Polyprotein. Für Mpro verwendeten wir ein neuartiges fluoreszierendes Tetrapeptidsubstrat, QS1 (Ac-Abu-Tle-Leu-Gln-ACC; KM = 207,3 ± 12 µM, kcat/KM = 859 ± 57 M−1 s−1)22. Das PLpro-Screening ergab nur die Identifizierung von Benzisoselenazolon 7 mit höherer Wirksamkeit als Ebselen. Verbindung 7 unterschied sich jedoch von den anderen Verbindungen in der Sammlung, da es das einzige untersuchte Ebselen-Derivat mit einer 3-substituierten Pyridinyleinheit anstelle eines substituierten Phenylrings war. Beim Mpro erzielten die Verbindungen 10 und 17 die besten Treffer. Verbindung 10 stellt monosubstituierte Derivate mit einer Nitrogruppe in para-Position dar, während 17 ein Derivat mit 2-Fluor- und 5-Chlor-Substitutionen im aromatischen Ring ist. Wir beobachteten, dass das 2,4-Dimethoxy-Derivat 16 eine Wirksamkeit gegenüber beiden Proteasen aufweist, die der von Ebselen ähnelt, allerdings war seine Toxizität, die in der menschlichen Zelllinie A549 bewertet wurde, im Vergleich zu Ebselen zehnmal geringer60. Im Allgemeinen verstärken Substitutionen innerhalb des Phenylrings von Ebselen die Hemmung von Mpro, da wir nur drei Verbindungen (6, 7 und 12) identifiziert haben, deren Wirksamkeit geringer ist als die von Ebselen. Die Screening-Ergebnisse finden Sie in Tabelle S2 in den Zusatzinformationen39.

Basierend auf den Screening-Ergebnissen haben wir Ebselen und sieben seiner Derivate für die weitere Bewertung der Hemmeigenschaften in IC50-Assays ausgewählt. Wir haben folgende Verbindungen ausgewählt: (a), die im Screening die höchste Wirksamkeit gegenüber Mpro (10, 17) oder PLpro (7) zeigten; oder (b), das eine relativ hohe Hemmung gegenüber beiden untersuchten Proteasen zeigt (3, 16, 20, 21). Während der Tests lagen die IC50-Werte für PLpro im mikromolaren Bereich, während sie für Mpro im niedrigen nanomolaren Bereich lagen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Für den Referenzinhibitor Ebselen betrugen die IC50-Werte 1,12 ± 0,06 µM für PLpro und 30,91 ± 2,67 nM für Mpro. Verbindung 7, die im PLpro-Inhibitor-Screening-Assay den besten Treffer erzielte, hatte tatsächlich den niedrigsten IC50-Wert (0,58 ± 0,04 µM) unter den getesteten Verbindungen. Obwohl Ebselen im Screening-Assay der zweitbeste PLpro-Inhibitor war, stellten wir fest, dass zwei andere Verbindungen (17, 21) etwas niedrigere IC50-Werte aufwiesen. Die Verbindungen 10 und 17, die für die Analyse als beste Mpro-Inhibitoren ausgewählt wurden, zeigten niedrigere IC50-Werte als Ebselen. Der wirksamste Mpro-Inhibitor mit IC50 = 15,24 nM war Verbindung 17, der zweitbeste Treffer aus dem Screening-Experiment. Interessanterweise zeigte der beste Treffer 10 einen IC50-Wert, der den für 3 und 21 ermittelten Werten ähnelte (27,95 nM, 25,69 nM bzw. 27,37 nM). Für 16 und 20 beobachteten wir, dass trotz einer höheren Wirksamkeit im Screening-Assay die für diese Verbindungen ermittelten IC50-Werte höher waren als für Ebselen.

IC50 ist ein testabhängiges Maß. Die für die Verbindungen erhaltenen niedrigen IC50-Werte sind wahrscheinlich auf die Eigenschaften der verwendeten Substrate zurückzuführen. SARS-CoV-2 PLpro besitzt deubiquitinierende Aktivität und das verwendete Ac-LRGG-ACC-Substrat hat einen relativ niedrigen kcat/KM-Wert (kcat/KM ≈ 900 s−1 M−1). Optimale Substrate für dieses Enzym basieren auf Ubiquitin oder ISG15-Molekülen26. Für SARS-CoV-2 Mpro verwendeten wir unser neuartiges fluoreszierendes Tetrapeptid-QS1-Substrat, das im Vergleich zu FRET-Substraten einen niedrigeren kcat/KM-Wert (kcat/KM = 859 s−1 M−1) aufweist22.

Ausgewählte Ebselen-Analoga – 3, 7, 10, 16 und 17 – wurden weiter auf ihre inhibitorischen Eigenschaften gegenüber nsp14-N7-MTase getestet. Um ihre IC50-Werte zu bestimmen, verwendeten wir den zuvor beschriebenen Fluoreszenztest Py-FLINT42,67. Zu diesem Zweck wurde die Py-FLINT-Sonde (1 μM) mit SAM-Cosubstrat (20 μM), nsp14-Enzym (40 nM) und halblogarithmischen Inhibitorverdünnungen in 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, bei 30 °C inkubiert. Der Reaktionsfortschritt wurde in 96-Well-Zellen durch Registrieren des Fluoreszenzintensitätssignals in einem Zeitintervall von 1 Minute überwacht. Anhand des anfänglichen Reaktionsverlaufs wurden die Werte der anfänglichen Geschwindigkeiten V berechnet. Um die IC50-Werte aus den erhaltenen Abhängigkeiten der Anfangsraten von der Inhibitorkonzentration zu berechnen, haben wir eine Dosis-Wirkungs-Gleichung mit vier Parametern angepasst und dabei eine variable Hill-Steigung p angenommen (Tabelle 3, Abb. S2).

Für die wirksamsten Inhibitoren (Verbindungen 3, 7 und Ebselen-Kontrolle) wurden hohe Werte der Hügelneigung beobachtet, und wir gehen davon aus, dass sie auf Einschränkungen der angewandten Fluoreszenzmethode zurückzuführen sind. Der Bereich der Hemmung, der in Konkurrenzexperimenten untersucht werden kann, wird durch die Affinität der Fluoreszenzsonde zum Protein begrenzt. Wir glauben, dass ein besser fluoreszierendes Substrat mit einem niedrigeren Wert der Michelis-Menten-Konstante eine bessere Unterscheidung zwischen starken nsp14-Inhibitoren ermöglichen würde, die in p ~ 1 sichtbar sind. Die Verbindungen 3, 7 und 16 hatten IC50-Werte, die mit Ebselen vergleichbar waren (0,35–0,42 μM), was darauf hindeutet, dass dies der Fall ist starke Inhibitoren von NSP14. Verbindungen mit 4-Nitrophenyl- (10) und 5-Chlor-2-fluorphenyl-Substitutionen (17) hatten eine um eine Größenordnung höhere IC50-Werte (3,08 ± 0,46 μM bzw. 3,83 ± 0,35 μM). Dieselben Substitutionen führten zu einer Erhöhung der Hemmwirkung gegen Mpro, was darauf hindeutet, dass Phenylringsubstitutionen ein möglicher Weg zur maßgeschneiderten Selektivität der Verbindungen sind. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass Ebselen und seine Derivate als Multi-Target-Inhibitoren der SARS-CoV-2-Proteinaktivität wirken könnten.

Um einen tieferen Einblick in die biologische Aktivität von Organoselenverbindungen zu erhalten, haben wir eine Sammlung von 11 Diseleniden – offene Formen verschiedener Ebselen-Derivate – in unsere Studie einbezogen. Zunächst führten wir ein Screening auf PLpro- und Mpro-Inhibitoren gemäß einem für Benzisoselenazol-3(2H)-one verwendeten Protokoll durch. Das Screening ergab, dass Diselenide beide Proteasen hemmen. Diselenide hemmten Mpro im Allgemeinen schlechter als Ebselen; Im Gegensatz zu Benzisoselenazolonen zeigten Diselenide für PLpro jedoch eine höhere Wirksamkeit als die Referenzverbindung (vollständige Screening-Ergebnisse finden Sie in Tabelle S3 mit ergänzenden Informationen). Der IC50-Parameter für die Proteasehemmung konnte aufgrund der hohen Hydrophobizität der Verbindungen und ihrer Ausfällung im Testpuffer nicht beurteilt werden. Als nächstes testeten wir Diselenide auf Anti-N7-MTase-Aktivität mit dem Py-FLINT-Assay. Alle getesteten Verbindungen zeigten IC50-Werte im hohen nanomolaren oder niedrigen mikromolaren Bereich (Tabelle 4). Wir haben beobachtet, dass für Verbindung 25 mit einem 2-fluorsubstituierten Phenylring der IC50 dreimal niedriger ist (0,12 ± 0,01 µM) als für Ebselen. Die „dimere Form“ von Ebselen 24 und sein 3-fluorsubstituiertes Derivat 27 zeigten ebenfalls einen etwa doppelt so niedrigen IC50-Wert wie Ebselen. Die Ergebnisse dieser Verbindungen korrelieren mit ihren niedrigen EC50-Werten in CPE- und RNA-basierten Tests (Tabelle 5).

In-vitro-Tests mit rekombinanten Enzymen zeigten, dass Ebselen, seine Derivate und Analoga eine inhibitorische Aktivität gegenüber SARS-CoV-2 Mpro, PLpro und nsp14 besitzen. Da wir wussten, dass Ebselendiselenid an den Katalysezyklen von Ebselen beteiligt ist und dass oxidativer Stress eine wichtige Rolle bei der SARS-CoV-2-Infektion spielt68, gingen wir davon aus, dass Ebselenanaloga – Bis(2-carbamoylaryl)phenyldiselenide – auch eine antivirale Aktivität in Zellen besitzen könnten. Unser nächster Schritt war die Bewertung der antiviralen Eigenschaften und der Zytotoxizität ausgewählter Ebselen-Analoga in Cellulo in der Vero-E6-Zelllinie69. Für dieses Experiment haben wir die verfügbaren dimeren Formen von Ebselen-Derivaten einbezogen (Strukturen in Tabelle 5 dargestellt). Um einen tieferen Einblick in die Aktivität der getesteten Verbindungen zu erhalten, führten wir vier Tests durch: einen auf zytopathischen Effekten basierenden Test, einen auf RNA-Reduktion basierenden Test, einen Virustiter-Reduktionstest und einen Zytotoxizitätstest. Verbindungen mit einem EC50-Wert von mehr als 20 µM im CPE-basierten Assay wurden von den RNA-Reduktions- und Virustiter-Reduktionsassays ausgeschlossen. Wir verwendeten Remdesivir als Positivkontrollmittel gegen SARS-CoV-2. Außer Ebselen überstieg der CC50-Wert aller getesteten Verbindungen 50 µM, was auf ihre im Allgemeinen geringe Zytotoxizität hinweist. Darüber hinaus zeigte Ebselen den zweithöchsten EC50-Wert im CPE-basierten Test. Für Ebselendiselenid (Bis(2-carbamoyl)diphenyldiselenid, 24) beobachteten wir jedoch die stärkste antivirale Reaktion (EC50 = 1,0 ± 0,14 µM im RNA-Reduktionstest) und die drittstärkste zytoprotektive Wirkung (EC50 = 1,5 ±). 0,13 µM im CPE-basierten Assay). Die höchste zytoprotektive Wirkung wurde für Bis[2-(3-fluorphenylcarbamoyl)]phenyldiselenid (27) beobachtet, das als einziges Diselenid einen EC50-Wert im nanomolaren Bereich aufwies (EC50 = 0,7 ± 0,13 µM). Die Verbindung zeigte auch eine hohe antivirale Aktivität mit dem zweitniedrigsten EC50 (1,5 ± 0,15 µM) im RNA-Reduktionstest. Eine weitere wirksame Verbindung war 30 mit einem 4-Chlor- und 2-Fluor-substituierten Phenylring, da sie im CPE-basierten Assay den zweitniedrigsten EC50-Wert aufwies. In den meisten Fällen beobachteten wir, dass bei Diseleniden mit Methyl- (32 und 33, mit Chlor-Gegenstücken) oder größeren Substituenten (28, 31 – Methoxy- und 26, 29 – Trifluormethyl-Gruppen) die zytoprotektive Wirkung verringert war, die antivirale Aktivität jedoch sich im Vergleich zu Verbindungen mit nur Halogenidsubstituenten im Phenylring nicht wesentlich ändern. Verbindung 34 mit einem 5-Chlor-2-fluor-substituierten Phenylring zeigte jedoch den höchsten EC50-Wert im auf RNA-Reduktion basierenden Assay und hatte im CPE-basierten Assay einen erheblich höheren EC50-Wert im Vergleich zu anderen Halogenid-substituierten Ebselen-Diselenid-Derivaten (25, 27, 30). Wir beobachteten, dass insbesondere Trifluormethylgruppen die Aktivität der Verbindungen beeinträchtigten, was zu den höchsten EC50-Werten im CPE-basierten Assay führte. Die Anti-SARS-CoV-2-Wirksamkeit von Diselenid-Derivaten wurde durch die Bestimmung der maximalen Virustiterreduktion bei EC90-Konzentration weiter bestätigt. Die Reduzierung des Virustiters lag zwischen 0,3 und 3,3 log10PFU/ml, wobei die Verbindung 25 die beste Reduzierung des Virustiters aufwies, gefolgt von den Verbindungen 24, 34 und 30.

Angesichts der über 6,86 Millionen durch COVID-19 verursachten Todesfälle ist die Notwendigkeit einer allgemein zugänglichen, wirksamen und sicheren Therapie gegen Coronaviren-Erkrankungen für die öffentliche Gesundheit von entscheidender Bedeutung. Eine vielversprechende Strategie ist die Mpro-Hemmung, und dieser Ansatz kann zu neuartigen antikoronaviralen Breitbandmedikamenten führen18. Kürzlich ermöglichten Bemühungen zur Umwidmung die Identifizierung von Ebselen als potenzielles Medikament gegen COVID-19, wahrscheinlich aufgrund seiner Wirkung als Inhibitor der Hauptprotease von SARS-CoV-29. Dieses Konzept wurde später von Amporndanai et al. unterstützt, die einen Mechanismus zur Selenierung des katalytischen Cys145-Rests von Mpro durch Ebselen39 vorschlugen. Darüber hinaus haben Menéndez et al. mithilfe von Molekulardynamiksimulationen festgestellt, dass erforschte nichtkovalente Wechselwirkungen zwischen dem Mpro und dem Ebselen-Molekül. Forscher fanden zwei mögliche Interaktionsstellen: eine innerhalb des aktiven Zentrums und die zweite in der Region, die an der Dimerbildung beteiligt ist70. Vielversprechende Ergebnisse aus Studien zu Ebselen als Anti-SARS-CoV-2-Wirkstoff inspirierten Forscher dazu, auch seine Derivate als potenzielle antivirale Mittel zu untersuchen. Węglarz-Tomczak et al. untersuchten Ebselen und seine Analoga als PLpro-Proteaseinhibitoren38. Qiao et al. entwarf und synthetisierte eine Reihe von Ebselen-Derivaten, um die Hemmung des SARS-CoV-2 Mpro zu verbessern. Die Forscher identifizierten drei Verbindungen, die in Tests zur zellulären antiviralen Aktivität, die in HPAepiC-Zellen durchgeführt wurden, Ebselen überlegen waren71. Sun et al. untersuchten Ebselen, Ebsulfur und ihre Derivate als Mpro-Inhibitoren. Unter nicht reduzierenden Bedingungen zeigten alle Verbindungen hemmende Eigenschaften. Allerdings war die Hemmung im DTT-abhängigen Screening-Assay verringert, was zu der Schlussfolgerung führte, dass Ebselen ein promiskoser Cystein-Protease-Inhibitor ist und seine antivirale Aktivität in Zellen möglicherweise nicht auf eine direkte Protease-Hemmung zurückzuführen ist. Die Rolle von Ebselen als Proteaseinhibitor wurde auch von Ma et al. in Frage gestellt, die zeigten, dass Ebselen in Abwesenheit eines Reduktionsmittels unspezifisch an aktive Stellen verschiedener Cysteinproteasen bindet72. In einer anderen Studie der Wang-Gruppe zeigte Ebselen in Protease-Glo-Luciferase- und Flip-GFP-Assays keine Mpro-Hemmung in Zellen. Die Autoren führten einen In-vitro-FRET-Substrattest mit rekombinantem Enzym durch und zeigten, dass Ebselen in Gegenwart eines Reduktionsmittels die Protease nicht hemmt73. Darüber hinaus beobachteten die Forscher mithilfe des Flip-GFP-Assays keine Hemmung von SARS-CoV-2 PLpro durch Ebselen in 293T-ACE2-Zellen74. Keine zelluläre Mpro-Hemmung wurde auch von Heilmann und Kollegen berichtet, die einen neuartigen, VSV-basierten Test zur Bewertung von Proteaseinhibitoren in Zellen entwickelten75.

Ebselen hat eine pleiotrope Wirkungsweise, die auf seine Reaktivität gegenüber Cysteinresten zurückzuführen ist, die viele biologische Ziele beeinflussen29,31,76. Eine der plausiblen Erklärungen für die hohe antivirale Aktivität von Ebselen und seinen Derivaten könnte ihre Funktion als Mimetika der GPx-Selenoenzyme sein, die für die Aufrechterhaltung niedriger ROS-Spiegel von entscheidender Bedeutung sind (Abb. 2). Der oxidative Stress spielt eine wichtige Rolle bei Virusinfektionen77, daher können Antioxidantien wie Organoselenverbindungen einen positiven Effekt haben. Darüber hinaus wurde die GPx1-Isoform als mögliches zelluläres SARS-CoV-2 Mpro-Substrat vorgeschlagen, sodass das Vorhandensein von Ebselen in Zellen der Erschöpfung des Enzyms entgegenwirken würde78. Darüber hinaus haben Du et al. haben gezeigt, dass die SARS-CoV-2 Mpro-Aktivität durch oxidativen Stress gefördert werden könnte79. Somit würde die antioxidative Aktivität von Ebselen indirekt die Aktivität von SARS-CoV-2 Mpro verringern, dieses Konzept bedarf jedoch weiterer Untersuchungen und experimenteller Bestätigung.

Organoselenverbindungen können aufgrund ihrer Panreaktivität gegenüber Thiolgruppen in höheren Konzentrationen toxisch wirken76. Die klinische Sicherheit von Ebselen wurde jedoch in mehreren Studien nachgewiesen, was diese Substanz zu einem guten Kandidaten für eine weitere Strukturoptimierung macht. Ebselen gehört zur Substanzbibliothek der NIH Clinical Collection, die Substanzen sammelt, die derzeit nicht klinisch verwendet werden, aber in der Vergangenheit in klinischen Studien am Menschen eingesetzt wurden. Seine Wirksamkeit und Sicherheit beim Menschen wurden in verschiedenen Studien untersucht. In einer klinischen Phase-I-Studie mit Ebselen als mögliche Behandlung von Hörverlust beim Menschen vertrugen die Patienten eine Einzeldosis von 1600 mg80. In einer doppelblinden Placebostudie der Phase IIa mit Ebselen zur Behandlung von Manie oder Hypomanie wurde das Medikament drei Wochen lang in Dosen von 600 mg verabreicht. Infolgedessen waren die Nebenwirkungen in beiden Gruppen vergleichbar81. Auch die zweiwöchige Verabreichung von Ebselen in Dosen von 300 mg pro Tag erwies sich als sicher für Patienten mit akutem ischämischen Schlaganfall82. Aufgrund seiner günstigen Pharmakokinetik und seines Sicherheitsprofils wird Ebselen schließlich als sicherere Alternative zu Lithiumsalzen bei bipolaren Störungen untersucht83.

In unserer Studie verwendeten wir eine Sammlung von Ebselen-Derivaten und -Analoga, um ihre SARS-CoV-2 PLpro- und Mpro-hemmenden Eigenschaften zu bewerten. Da Ebselen als starker nsp14-N7-MTase-Inhibitor identifiziert wurde, haben wir unsere Reihe von Ebselen-Analoga auch gegen SARS-CoV-2 nsp14 bewertet. Zuerst haben wir eine Bibliothek von Organoselenverbindungen gescreent. Als nächstes haben wir die IC50-Werte für ausgewählte Verbindungen bestimmt. Der wirksamste PLpro-Inhibitor, 2-(3-Hydroxypyridin-2-yl)-1,2-benzisoselenazol-3(2H)-on, zeigte im Screening-Assay die höchste Wirksamkeit und den niedrigsten IC50-Wert (0,58 µM). Durch die IC50-Bestimmung konnten zwei weitere Verbindungen mit ähnlichen Hemmeigenschaften wie Ebselen identifiziert werden. Bei diesen Verbindungen handelte es sich um 2,4- und 2,5-disubstituierte Derivate von Ebselen, die beim Screening eine geringere Wirksamkeit, aber auch etwas niedrigere IC50-Parameter als der Referenzinhibitor zeigten. Eine ähnliche Analyse für Mpro ermöglichte die Identifizierung von vier Verbindungen, die während des Screenings eine höhere Wirksamkeit und einen niedrigeren IC50-Parameter aufwiesen. Zwei davon hatten einen monosubstituierten Phenylring in para- und ortho-Position, und zwei waren disubstituierte Ebselen-Derivate. Der beste Inhibitor mit einem etwa doppelt so niedrigen IC50-Wert als Ebselen war 2-(5-Chlor-2-fluorphenyl)-1,2-benzisoselenazol-3(2H)-on. Unter den getesteten Ebselen-Derivaten fanden wir Verbindungen mit 2-Bromphenyl- und 2-(3-Hydroxypyridin-2-yl)-Modifikationen mit inhibitorischen Eigenschaften gegenüber nsp14 ähnlich wie Ebselen.

Ein weiterer Teil der Forschung war die Bewertung der antiviralen und zytoprotektiven Aktivität von Ebselen und seinen Diselenid-Analoga. Wir haben 12 selenoorganische Verbindungen und Remdesivir (Positivkontrolle) in Vero E6-Zellen getestet. CPE- und RNA-Reduktionstests ergaben, dass diese Verbindungsklasse eine Quelle vielversprechender Kandidaten für neue antivirale Wirkstoffe sein könnte. Die Zytotoxizität der Diselenide war im Allgemeinen gering (CC50 > 50 µM). Wir beobachteten, dass für Ebselendiselenid und 3 von 4 Diseleniden mit Halogensubstitutionen im Phenylring der EC50-Wert in den auf CPE-Reduktion basierenden Tests am niedrigsten war. Ebselendiselenid zeigte auch die höchste antivirale Aktivität im RNA-Reduktionstest. Die Substitution mit größeren Gruppen führte zu einer geringeren zytoprotektiven Aktivität (höherer EC50 im CPE-Reduktionstest), ein ähnlicher Effekt wurde jedoch nicht für die antivirale Aktivität beobachtet.

In dieser Arbeit haben wir gezeigt, dass Ebselen-Derivate mit Substitutionen und anderen Modifikationen innerhalb des Phenylrings unter nicht reduzierenden Bedingungen in In-vitro-Assays im Allgemeinen gute inhibitorische Eigenschaften sowohl gegen die Proteasen als auch gegen die vom neuen Coronavirus kodierte N7-Guanin-Methyltransferase besitzen. Darüber hinaus besitzen Ebselen-Diselenid-Derivate eine hohe antivirale und zytoprotektive Aktivität. Die Ergebnisse stellen eine vielversprechende Plattform für neuartige Therapeutika dar und wir glauben, dass die Daten dazu genutzt werden können, die Bemühungen um neue antikoronavirale Medikamente zur Behandlung von COVID-19 zu erleichtern.

Alle Lösungsmittel wurden vor Gebrauch destilliert. Im Handel erhältliche Reagenzien wurden ohne weitere Reinigung verwendet. Selenpulver (100 Mesh) (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA), das für die Herstellung von Na2Se2 und Li2Se2 verwendet wurde, hatte eine Reinheit von ≥ 99,5 %. Frisch destilliertes MeCN wurde vor der Herstellung von Ebselen und seinen Derivaten zweimal über P2O5 erneut destilliert. MeOH wurde vor der Hydrierung von Ebselen langsam über einer Mischung aus LAH und CaH2 destilliert. CH2Cl2 (DCM) wurde vor der Herstellung der Ebselen-Analoga 25–34 über P2O5 destilliert. Über NaOH destilliertes Triethylamin (Et3N) (POCh, Gliwice, Polen) wurde über NaOH-Pellets gelagert. Wasserfreies Natriumcarbonat (Na2CO3) (POCh, Gliwice, Polen) wurde vor der Verwendung in einem Mörser gemahlen. Die Zwischenprodukte 2-(Chlorseleno)benzoylchlorid und Bis[(2-chlorcarbony)phenyl]diselenid wurden aus Anthranilsäure und elementarem Selen über die Bildung von 2,2′-Dicarboxydiphenyldiselenid hergestellt – einem Schlüsselzwischenprodukt gemäß dem Literaturverfahren60 ,61,63,64. Die präparative Säulenchromatographie wurde auf Merck Si60-Kieselgel (63–200 µm) durchgeführt. Die analytische DC wurde an mit Kieselgel (Merck Kieselgel, 60 F254) (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA) vorbeschichteten PET-Folien durchgeführt und mit Licht (λmax = 254 nm) oder durch Anfärben mit Joddampf sichtbar gemacht . Die Schmelzpunkte wurden auf einem digitalen Schmelzpunktgerät Electrothermal IA 91100 unter Verwendung der Standardmethode mit offener Kapillare bestimmt. IR-Spektren (4000–400 cm−1) wurden in KBr-Platten auf einem Perkin-Elmer 2000 FT-IR-Spektrometer oder auf einem Fourier-Transformations-Bruker VERTEX 70V-Spektrometer unter Verwendung von Diamant-ATR-Zubehör aufgezeichnet. Absorptionsmaxima werden in Wellenzahlen (cm−1) angegeben. 1H-NMR- und 13C-NMR-Spektren (300,1, 399,8, 600,6 MHz bzw. 75,48, 100,5, 151,0 MHz) wurden auf einem Bruker DRX 300 (Bruker, Rheinstetten, Deutschland), Jeol 400yh (Jeol, Tokio, Japan) und aufgezeichnet Bruker Avance II 600 (Bruker, Posen, Polen) Instrumente. In CHCl3-d1 und DMSO-d6 aufgezeichnete NMR-Spektren wurden auf die jeweiligen 1H- oder 13C-Restsignale der Lösungsmittel bezogen, und chemische Verschiebungen (δ) sind in Teilen pro Million (ppm) und Kopplungskonstanten (J) in Hz angegeben . 19F-NMR und 77Se-NMR (376,2 bzw. 76,24 MHz) wurden auf dem Jeol 400yh-Instrument gesammelt. Hochauflösende Massenspektren wurden mittels Elektrospray-Ionisation auf einem Waters LCT Premier XE TOF-Instrument gesammelt.

Das Literaturverfahren wurde für die Herstellung von Dilithiumdiselenid62, Diaryldiseleniden 2484, 2860,63, 3160, 32–3363, 3660,64, 3860 und 2-(Chlorseleno)benzoylchlorid (37)60 angepasst. Reinheit und Homogenität bekannter Verbindungen wurden durch Messung ihres Schmelzpunktes für Ebselen60, 1–258, 357, 7–860, 985, 1186, 1660, 19–2263, 2360, 2487, 2687, 2863, 2987, 3160, 32–3363 bestätigt , 3686, 3788 und 3886, oder FT-IR-Spektren für Ebselen57, 357, 1066, 1186, 1660, 3160, 1H- und/oder 13C-NMR-Spektren für 1–258, 759,60, 863, 1086, 1186, 1660, 19–2263, 2360, 2484, 2863, 3160, 3263 und 77Se-NMR-Spektrum für 1066 und HRMS für 1660 und Vergleich mit Literaturdaten. Alle neuen 13, 30, 34, nicht charakterisierten, 489, 587, 690, 985, 1291, 1491, 1592, 17–1893, 2592, 2792 und spektroskopisch nicht charakterisierten 26, 2987 Selenarten wurden vollständig charakterisiert. Die Positionen der Wasserstoff- und Kohlenstoffatome in den 1H-NMR- und 13C-NMR-Spektren wurden durch die dept-135- oder COSY-Experimente und durch 2D-NMR-Kartenanalyse der heteronuklearen Mehrfachquantenkorrelation (HMQC) und der heteronuklearen Mehrfachbindungskorrelation (HMBC) gestützt ), Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy (NOESY), falls gemessen. Detaillierte Syntheseprotokolle und spektroskopische Charakterisierung der Verbindungen finden Sie in den Hintergrundinformationen.

SARS-CoV-2 PLpro wurde wie beschrieben vorbereitet26. Kurz gesagt, pGEX6P-1-SARS-CoV-2PLpro wurde in E. coli-Zellen mit BL21 (DE3)-Codon plus transformiert und mit 0,1 mM IPTG und 0,1 mM ZnSO4 bei 18 °C über Nacht induziert. GST-fusion SARS-CoV-2 PLpro wurde unter Verwendung eines Standardprotokolls gereinigt. Das Fusionsprotein wurde mit GST-PreScission-Protease bei 4 °C über Nacht gespalten, anschließend entsalzt und durch frische Glutathionkügelchen geleitet, um gespaltene GST- und GST-PreScission-Protease zu entfernen. Die Probe wurde unter Verwendung von Superdex 200 pg Größenausschlusssäulen (GE), äquilibriert mit 20 mM Tris-Cl pH 8,0, 40 mM NaCl und 2 mM DTT, weiter gereinigt. Die Peakfraktionen wurden gepoolt und auf ~ 10 mg/ml konzentriert und zur späteren Verwendung in flüssigem Stickstoff eingefroren.

SARS-CoV-2 Mpro wurde wie beschrieben rekombinant hergestellt18. Kurz gesagt, das Gen des Mpro wurde in den PGEX-6p-1-Vektor kloniert, der am N- bzw. C-Terminus eine Nsp4-Nsp5- und eine PreScission-Spaltungsstelle aufweist, um das authentische Zielprotein zu erzeugen. Das Gen des Zielproteins wurde im E. coli des Stammes BL21-Gold (DE3) (Novagen) exprimiert. Das rekombinant hergestellte Mpro wurde mithilfe von HisTrap FF (GE Healthcare) und Ionenaustauschchromatographie (Q FF, GE Healthcare) gereinigt. Abschließend wurde das hochreine Zielprotein für weitere Experimente einem Pufferaustausch (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, pH 7,8) unterzogen.

SARS-CoV-2-mRNA-Cap-Guanin-N7-Methyltransferase nsp14 wurde wie zuvor beschrieben hergestellt42. Kurz gesagt, das nsp14-Gen wurde in den pET28 SUMO-Expressionsvektor kloniert. Nsp14 wurde in BL21 (DE3) RIL E. coli (Invitrogen) als Fusionsprotein mit His-markiertem SUMO überexprimiert. Das Fusionsprotein wurde unter Verwendung einer HisTrap FFTM-Säule (Cytiva) gereinigt und anschließend auf eine HiTrap 26/10-Entsalzungssäule (Cytiva) geladen. Um den N-terminalen Tag (6 × His-Sumo) zu entfernen, wurde Sumo-Protease (MCLAB) hinzugefügt und dann das nsp14-Protein erneut auf einer HisTrap-FFTM-Säule gereinigt. Nsp14 enthaltende Durchflussfraktionen wurden gesammelt und vom N-terminalen Tag (6 × His-Sumo) und der His-markierten Sumo-Protease getrennt. Die Durchflussfraktion wurde auf einer Superdex 75 pg HiLoad 26/600-Gelfiltrationssäule (Cytiva) abschließend weiter gereinigt. Nsp14 enthaltende Fraktionen wurden auf 30 μM konzentriert, schockgefroren und bei –80 °C in einem Puffer gelagert, der 50 mM HEPES (pH 8,0), 100 mM NaCl, 1 mM DTT und 10 % Glycerin enthielt.

Die Auswertung der Verbindungsbibliothek für Inhibitoren von SARS-CoV-2 PLpro und SARS-CoV-2 Mpro wurde in Corning 96-Well-Platten durchgeführt. Für PLpro wurde 1 µL jeder Verbindung in DMSO-Lösung in die Vertiefungen gegeben. Als nächstes wurden 79 µL Enzym, das 10 Minuten lang bei 37 °C in Testpuffer (50 mM Tris, 5 mM NaCl, 0,075 % BSA, pH 7,5) vorinkubiert wurde, in jede Vertiefung gegeben. Das Enzym wurde mit den Verbindungen 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Als nächstes wurden 20 µL Ac-LRGG-ACC-Substrat in Testpuffer in die Vertiefungen gegeben. Die Endkonzentrationen betrugen: 100 nM Enzym, 10 µM Substrat und 1 µM getestete Verbindungen. Im Assay für Mpro wurde 1 µL jeder Verbindung in DMSO-Lösung in die Vertiefungen gegeben. Als nächstes wurden 79 µL Enzym in Testpuffer (50 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,3)94 in jede Vertiefung gegeben und die Platte wurde 2 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Als nächstes wurden 20 µL QS1-Substrat in Testpuffer in die Vertiefungen gegeben. Die Endkonzentrationen betrugen: 100 nM Enzym, 50 µM Substrat und 100 nM oder 1 µM getestete Verbindungen. Die Messungen wurden bei 37 °C mit einem Spectramax Gemini XPS-Spektrofluorometer von Molecular Devices durchgeführt. Die Freisetzung des ACC-Fluorophors wurde 30 Minuten lang überwacht (λex = 355 nm, λem = 460 nm). Für die weitere Analyse wurde der lineare Bereich der Verlaufskurven genutzt. Die Messungen wurden mindestens zweifach durchgeführt. Die Ergebnisse wurden als Mittelwerte der relativen Enzymhemmung (% im Vergleich zur Kontrollmessung ohne Inhibitor) mit Standardabweichungen dargestellt. Während der Tests betrug die endgültige DMSO-Konzentration in den Vertiefungen < 2 %.

Zur Bestimmung der IC50 wurde die relative Aktivität der untersuchten Proteasen in mindestens 11 verschiedenen Konzentrationen ausgewählter Inhibitoren bewertet. Die anfänglichen Konzentrationen der Verbindungen wurden experimentell ermittelt. Reihenverdünnungen von Inhibitoren in Testpuffern (oben beschrieben) wurden in Platten mit 96 Vertiefungen hergestellt (20 µl jeder Verdünnung in Vertiefungen). Für SARS-CoV-2 PLpro wurden 60 µL Enzym, das 10 Minuten lang bei 37 °C in Testpuffer vorinkubiert wurde, in die Vertiefungen gegeben. Das Enzym wurde mit Inhibitoren 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Als nächstes wurden 20 µL Substrat (Ac-LRGG-ACC) in Testpuffer in die Vertiefungen gegeben. Die Endkonzentrationen betrugen 100 nM Enzym und 10 µM Substrat. Für SARS-CoV-2 Mpro wurden 60 µL Enzym ohne Vorinkubation hinzugefügt. Das Enzym wurde mit Inhibitor 2 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Als nächstes wurden 20 µL Substrat (QS1) im Testpuffer in die Vertiefungen gegeben. Die Endkonzentrationen betrugen 100 nM für das Enzym und 50 µM für das Substrat. Die Messungen wurden bei 37 °C mit einem Spectramax Gemini XPS-Spektrofluorometer von Molecular Devices durchgeführt. Die Freisetzung des ACC-Fluorophors wurde 30 Minuten lang überwacht (λex = 355 nm, λem = 460 nm). Die IC50-Werte wurden mit der GraphPad Prism-Software mithilfe einer nichtlinearen Regression (Dosis-Wirkungs-Inhibitionsgleichung) bestimmt und als relative Enzymaktivität gegenüber der Inhibitorkonzentration dargestellt. Die Messungen wurden mindestens dreifach durchgeführt. Die Ergebnisse werden als Mittelwerte mit Standardabweichungen dargestellt. Während der Tests betrug die DMSO-Konzentration in den Vertiefungen < 2 %. Siehe Zusatzinformationen zu IC50-Diagrammen.

Um die IC50-Parameter von Ebselen-Analoga gegenüber dem nsp14-Enzym zu bestimmen, verwendeten wir den zuvor beschriebenen Py-FLINT-Assay, der für N7-MTase-Aktivitätsstudien entwickelt wurde42,67. Die Py-FLINT-Sonde (1 μM) wurde mit SAM-Cosubstrat (20 μM), nsp14 (40 nM) und einem Inhibitor (halblogarithmische Verdünnungen logCinh < − 2,5; 2 >) inkubiert. Punktfluoreszenzmessungen (λex = 345 nm, λem = 378 nm) wurden in schwarzen, nicht bindenden Assayplatten mit 96 Vertiefungen bei 30 °C durchgeführt. Die anfänglichen Raten V wurden durch Anpassen einer linearen Kurve an die ersten 10 Punkte (10 Minuten) berechnet. An die erhaltenen Abhängigkeiten V(Cinh) wurde die folgende Dosis-Wirkungs-Gleichung mit vier Parametern angepasst:

wobei A1 und A2 die unteren bzw. oberen Asymptoten sind; Cinh die Inhibitorkonzentration; p ist der Hill-Koeffizient und V/V0 ist das Verhältnis der anfänglichen Reaktionsgeschwindigkeit mit dem Inhibitor zu der ohne Inhibitor. Für die Kurvenanpassung und IC50-Berechnungen verwendeten wir die GraphPad Prism-Software.

Die Anti-SARS-CoV-2-Aktivität wurde gemessen, indem das Ausmaß bestimmt wurde, in dem die Verbindungen den virusinduzierten zytopathischen Effekt (CPE) hemmten und die SARS-CoV-2-RNA in Vero-E6-Zellen reduzierten (ECACC 85020206). Für den CPE-basierten Assay wurden zweifache Reihenverdünnungen der Verbindungen in dreifacher Ausfertigung in eine 384-Well-Platte mit 5000 Vero E6-Zellen in DMEM-Medium mit 2 % FBS, 100 U Penicillin/ml und 100 µg Streptomycin gegeben /ml (alle Merck). Nach einstündiger Inkubation wurde SARS-CoV-2 (Stamm hCoV-19/Tschechische Republik/NRL_6632_2/2020 wurde in einem Labor der Biosicherheitsstufe 3 aus Nasopharynxabstrichen durch Inokulation von Vero CCL81-Zellen [ECACC 84113001] isoliert) mit einer Infektionsmultiplizität von 0,05 hinzugefügt IE/ml. Nach dreitägiger Inkubation bei 37 °C in 5 % CO2 wurde die Lebensfähigkeit der Zellen durch Zugabe von XTT-Lösung (Sigma-Aldrich) für 4 Stunden bestimmt und die Absorption mit einem EnVision-Plattenlesegerät (Perkin Elmer) gemessen. Die Arzneimittelkonzentrationen, die erforderlich sind, um die virale zytopathische Wirkung um 50 % (EC50) zu reduzieren, wurden mithilfe einer nichtlinearen Regression aus Diagrammen der prozentualen Lebensfähigkeit der Zellen gegenüber der log10-Arzneimittelkonzentration mit der Software GraphPad Prism v.9.0.0 berechnet. Für den auf RNA-Reduktion basierenden Assay wurden zweifache Reihenverdünnungen der Verbindungen in dreifacher Ausfertigung in eine 96-Well-Platte mit 20.000 Vero-Zellen gegeben, die am Tag zuvor im gleichen Medium wie oben ausplattiert wurden. Nach einstündiger Inkubation wurde SARS-CoV-2 mit einer Infektionsmultiplizität von 0,05 IU/Zelle hinzugefügt. Nach 2 Stunden wurde das Virus entfernt und den Zellen eine neue Verbindung zugesetzt. Die Zellen wurden zwei Tage lang inkubiert, dann wurde das Medium als Matrize in der RT-qPCR (Multiplex RT-PCR für COVID-19, Diana Biotechnologies, Tschechische Republik) verwendet. Die zur Reduzierung der SARS-CoV-2-RNA-Kopienzahl um 50 % (EC50) erforderlichen Verbindungskonzentrationen wurden aus Diagrammen des Prozentsatzes der RNA-Kopienzahl gegenüber der log10-Arzneimittelkonzentration wie oben berechnet.

Die maximale Titerreduktion für ausgewählte Verbindungen wurde bei der EC90-Konzentration bestimmt, die aus EC50-Bestimmungen unter Verwendung der Gleichung EC90 = 9√H × EC50 berechnet wurde, wobei H die Hill-Steigung ist. Kurz gesagt, die EC90-Konzentration ausgewählter Verbindungen wurde in dreifacher Ausfertigung zu 20.000 24 Stunden zuvor ausgesäten Vero E6-Zellen gegeben, 1 Stunde lang inkubiert und SARS-CoV-2 mit MOI = 0,05 IU/ml zugegeben. Nach einer Stunde Inkubation bei 37 °C wurde das 5 % CO2-Medium entfernt und frische Verbindungen bei EC90 hinzugefügt und 48 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Als Kontrolle wurde Remdesivir mit einbezogen. Die Titerreduktion wurde durch Plaque-Assay in Vero-E6-Zellen bestimmt. Kurz gesagt, der Virusüberstand wurde entfernt, zehnfach seriell in einer 24-Well-Platte verdünnt, gefolgt von der Zugabe von 300.000 Vero E6-Zellen und einer 4-stündigen Inkubation bei 37 °C, 5 % CO2. Anschließend wurde die Suspension mit 1,5 % (w/v) Carboxymethylcellulose in DMEM überschichtet und 5 Tage lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen einmal mit 1 × PBS gewaschen, 45 Minuten lang mit Naphthalinschwarz gefärbt, mit ddH2O gewaschen und an der Luft getrocknet. Die Plaques wurden gezählt und der Unterschied zwischen der Kontrolle ohne Arzneimittel und dem Titer des zusammengesetzten Virus wurde als log10 Plaque-bildende Einheiten (PFU) pro ml ausgedrückt.

Die Zytotoxizität wurde durch Inkubation zweifacher Verdünnungsreihen jeder Verbindung mit Vero-E6-Zellen bewertet. Nach dreitägiger Inkubation bei 37 °C in 5 % CO2 wurde die Lebensfähigkeit der Zellen durch Zugabe von XTT-Lösung wie oben bestimmt. Die Verbindungskonzentrationen, die zu einer 50-prozentigen Verringerung der Absorption führten (CC50), wurden wie oben aus Diagrammen der prozentualen Absorption gegenüber der log10-Arzneimittelkonzentration berechnet.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

α-Aminobuttersäure

7-Amino-4-carbamoylmethylcumarin

Dichlormethan

Dimethylformamid

Triethylamin

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Diese Arbeit wurde von der Medizinischen Forschungsagentur in Polen durch ihr eigenes Projekt (Zuschuss 2020/ABM/SARS/1) und vom Nationalen Wissenschaftszentrum in Polen mit der Zuschussnummer (2020/01/0/NZ1/00063) an MD und ( UMO-2020/01/0/ST4/00124) an JJ Das Drag-Labor wird durch das Projekt „TEAM/2017-4/32“ unterstützt, das im Rahmen des von der Europäischen Union kofinanzierten TEAM-Programms der Stiftung für polnische Wissenschaft durchgeführt wird im Rahmen des Europäischen Fonds für regionale Entwicklung. Die Arbeiten im Hilgenfelder Labor wurden durch das SCORE-Projekt der Europäischen Union (Fördervereinbarung Nr. 101003627), durch das Deutsche Zentrum für Infektionsforschung (DZIF) und durch den Struktur- und Exzellenzfonds des Landes Schleswig-Holstein gefördert Zum Beispiel durch eine enge Partnerschaft zwischen der Possehl-Stiftung (Lübeck) und der Universität zu Lübeck. Die Bestimmung der Anti-SARS-CoV-2-Aktivität wurde vom EFRE/ESF-Projekt ChemBioDrug CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000729 und dem Institut für Organische Chemie und Biochemie des CAS (RVO 61388963) unterstützt. Das Olsen-Labor wird durch CPRIT RR200030 und NIH R01 GM115568 und GM128731 unterstützt. Wir danken der Technischen Universität Breslau für die Unterstützung des Fachbereichs Organische und Medizinische Chemie – K20 (Satzungsfonds 82013902).

Abteilung für Chemische Biologie und Bioimaging, Breslauer Universität für Wissenschaft und Technologie, Wyb. Wyspianskiego 27, 50-370, Breslau, Polen

Mikolaj Zmudzinski, Wioletta Rut & Marcin Drag

Abteilung für Organische und Medizinische Chemie, Fakultät für Chemie, Wissenschaftlich-Technische Universität Breslau, Wyb. Wyspianskiego 27, 50-370, Breslau, Polen

Kamila Olech, Jaroslaw Granda, Miroslaw Giurg, Małgorzata Burda-Grabowska und Rafał Kaleta

Institut für Organische Chemie und Biochemie, Tschechische Akademie der Wissenschaften, Flemingovo Nám. 2, 16610, Prag, Tschechische Republik

Michala Zgarbova & Jan Weber

Zentrum für Neue Technologien, Universität Warschau, Banacha 2C, 02-097, Warschau, Polen

Renata Kasprzyk & Jacek Jemielity

Hochschule für interfakultäre Einzelstudien in Mathematik und Naturwissenschaften, Universität Warschau, Banacha 2C, 02-097, Warschau, Polen

Renata Kasprzyk

Institute of Molecular Medicine, University of Lübeck, Ratzeburger Allee 160, 23562, Lübeck, Germany

Linlin Zhang, Xinyuanyuan Sun und Rolf Hilgenfeld

Abteilung für Biochemie und Strukturbiologie, University of Texas Health Science Center in San Antonio, San Antonio, TX, 78229, USA

Zongyang Lv, Digant Nayak & Shaun K. Olsen

Nationales Arzneimittelinstitut, Ul. Chełmska 30/34, 00-725, Warschau, Polen

Malgorzata Kesik-Brodacka

German Center for Infection Research (DZIF), Hamburg-Lübeck-Borstel-Riems Site, University of Lübeck, 23562, Lübeck, Germany

Rolf Hilgenfeld

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MZ und MD haben die Forschung entworfen; MZ, WR und M.Zg. führte die Recherche durch und sammelte Daten; KO, JG, MG und MB-G. synthetisierte und stellte die Sammlung der Verbindungen MK-B., LZ, XS und RH bereit, die das SARS-CoV-2-Mpro-Enzym lieferten; ZL, DN und SKO stellten das SARS-CoV-2-PLpro-Enzym zur Verfügung, MZ, WR und JW analysierten und interpretierten die Hemmdaten und MZ verfasste das Manuskript; Alle Autoren haben das Manuskript kritisch überarbeitet.

Korrespondenz mit Mikolaj Zmudzinski oder Marcin Drag.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Zmudzinski, M., Rut, W., Olech, K. et al. Ebselen-Derivate hemmen die SARS-CoV-2-Replikation durch Hemmung seiner essentiellen Proteine: PLpro- und Mpro-Proteasen sowie nsp14-Guanin-N7-Methyltransferase. Sci Rep 13, 9161 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35907-w

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Eingegangen: 11. April 2022

Angenommen: 25. Mai 2023

Veröffentlicht: 06. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35907-w

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